石永強(qiáng)，趙向陽(yáng)，王輝

(溧水縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇溧水 211200)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因尚不明確的主要發(fā)生在結(jié)腸黏膜層的非特異性炎性病變。目前認(rèn)為，UC的發(fā)病與遺傳、環(huán)境、感染和免疫等多種因素相互作用有關(guān)，屬于自身免疫性疾病的一種。研究表明，UC的發(fā)病與Th細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)失衡密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚未闡明［1］。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB p65)在UC的發(fā)生發(fā)展中為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn);白介素17(IL-17)是由Th17產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，在炎癥性疾病及自身免疫病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用;細(xì)胞質(zhì)銜接蛋白(Act1)是介導(dǎo)IL-17信號(hào)和活化NF-κB p65之間的唯一銜接蛋白。本研究通過(guò)檢測(cè)UC腸黏膜組織中Act1、NF-κB p65、IL-17的表達(dá)水平分析三者之間的相關(guān)關(guān)系，探討三者在UC發(fā)病機(jī)制中的作用及機(jī)制，為UC的治療提供新的作用靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年1月至2012年12月在江蘇省溧水縣人民醫(yī)院內(nèi)鏡檢查明確診斷為UC活動(dòng)期的患者30例，均符合公認(rèn)的臨床UC診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。其中男17例，女13例，年齡18～66歲，平均(41±3)歲，病程1個(gè)月～10年。正常對(duì)照組30例，男18例，女12例，年齡18～53歲，平均(38±2)歲，為健康體檢者或結(jié)腸單發(fā)息肉切除術(shù)后復(fù)查腸鏡結(jié)果正常者，均無(wú)其他疾病。

1.2 標(biāo)本采集

均在患者病變最明顯腸段黏膜潰瘍邊緣或充血水腫最明顯處多點(diǎn)取材(6～8個(gè)點(diǎn))。正常對(duì)照者均在乙狀結(jié)腸處取材(6～8個(gè)點(diǎn))?；顧z組織經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色，觀察組織學(xué)形態(tài)并進(jìn)行病理分級(jí)。

1.3 UC患者的病理分級(jí)

UC患者的組織切片由兩位病理科醫(yī)師閱片，按Truelove-Richards標(biāo)準(zhǔn)［3］進(jìn)行病理學(xué)分級(jí)。Ⅰ級(jí):無(wú)明顯炎癥;Ⅱ級(jí):輕～中度炎癥;Ⅲ級(jí):重度炎癥。

1.4 免疫組化 SP 法檢測(cè) Act1、IL-17、NF-κB p65的表達(dá)

切片脫蠟，3%過(guò)氧化氫處理，高壓鍋加壓修復(fù)抗原，以3%正常小牛血清封閉，一次滴加鼠抗人Act1多克隆抗體、鼠抗人 NF-κB p65單克隆抗體、鼠抗人IL-17單克隆抗體，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，SP復(fù)合物，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。所有標(biāo)本均采用Image-Pro Plus型全自動(dòng)醫(yī)學(xué)圖像彩色分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像半定量分析，每個(gè)樣本隨機(jī)選5個(gè)染色較好的高倍視野(×400)，測(cè)定細(xì)胞棕黃色和棕褐色陽(yáng)性表達(dá)顆粒的積累吸光度(integrated optical density，IOD)值，IOD值越高，說(shuō)明陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 入選UC患者的臨床病理特點(diǎn)

30例UC患者臨床類(lèi)型多呈慢性復(fù)發(fā)型，病變部位多位于直腸、乙狀結(jié)腸。按Southerland疾病活動(dòng)指數(shù)(Mayo指數(shù))進(jìn)行疾病分期［4］，入選患者均為活動(dòng)期。按Truelove-Richards標(biāo)準(zhǔn)病理學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)10例、Ⅱ級(jí)17例、Ⅲ級(jí)3例。

2.2 UC 患者結(jié)腸黏膜組織 Act1、NF-κB p65、IL-17的表達(dá)

30例UC組結(jié)腸黏膜表面上皮細(xì)胞和固有層Act1、NF-κB p65、IL-17 均呈陽(yáng)性表達(dá)，而且表達(dá)與正常對(duì)照組比較顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。UC 結(jié)腸黏膜組織中 Act1、NF-κB p65、IL-17的表達(dá)隨著組織病理分級(jí)的增高而逐漸增強(qiáng)，Ⅲ級(jí)＞Ⅱ級(jí)＞Ⅰ級(jí)，不同病理分級(jí)間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 Act1、IL-17 與 NF-κB p65 表達(dá)之間的相關(guān)性

根據(jù)病理分級(jí)，UC患者結(jié)腸黏膜組織中 Act1、NF-κB p65與IL-17的表達(dá)均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r值分別為 0.906、0.912(P ＜0.05)。

表1 各組結(jié)腸黏膜中 Act1、NF-κB p65、IL-17表達(dá)及其與組織病理分級(jí)的關(guān)系(IOD值)(±s)Tab 1 The relationship between the Act1，NF-κB p65，IL-17 expression in colonic mucosa and its histopathological grading(The value of IOD)±s)

表1 各組結(jié)腸黏膜中 Act1、NF-κB p65、IL-17表達(dá)及其與組織病理分級(jí)的關(guān)系(IOD值)(±s)Tab 1 The relationship between the Act1，NF-κB p65，IL-17 expression in colonic mucosa and its histopathological grading(The value of IOD)±s)

組 別 n Act1 NF-κB p65 IL-17正常對(duì)照組30 0.21 ±0.02 0.22 ±0.01 0.45 ±0.02 UC組Ⅰ級(jí) 10 1.04 ±0.05 3.24 ±0.09 2.06 ±0.03Ⅱ級(jí) 17 2.03 ±0.07 6.29 ±0.13 4.71 ±0.13Ⅲ級(jí)3 5.03 ±0.08 10.02 ±0.15 7.21 ±0.15

3 討 論

UC是一種病因尚不明的、主要發(fā)生在結(jié)腸黏膜層的非特異性炎性病變，以潰瘍糜爛為主，多累及遠(yuǎn)端結(jié)腸，也可遍及全結(jié)腸，以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主要癥狀。UC的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［5］。目前認(rèn)為其原因是易感基因、環(huán)境因素及免疫因素之間相互作用，引起黏膜免疫活性細(xì)胞激活，產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致腸黏膜組織炎癥［6］。

研究［7］證實(shí)，NF-κB在 UC的發(fā)生、發(fā)展中作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的基因中起關(guān)鍵作用。NF-κB含有P50和P65兩個(gè)亞基。P65在正常組織不表達(dá)或低表達(dá)，而在活動(dòng)期UC有不同程度高表達(dá)［8］。

研究［9］表明，UC的發(fā)病與Th細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)失衡密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚未闡明。Th17是區(qū)別于典型Th1和Th2的CD4+輔助細(xì)胞，IL-17是由Th17產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，能激活并募集大量的中性粒細(xì)胞聚集到炎癥部位，從而引起并擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。Stasi等［10］研究證實(shí)，IL-17促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子IL-6及TNF-α的合成并參與炎癥反應(yīng)，提示以分泌IL-17為主的Th17細(xì)胞在炎性疾病的發(fā)病中具有比Th1/Th2更重要的作用。有研究［11-12］發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸黏膜含有較高水平的Th17細(xì)胞，IL-17的表達(dá)相對(duì)于正常人結(jié)腸黏膜顯著增高。

Act1是一種胞質(zhì)蛋白，通過(guò)作用于T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)自身免疫［13］。有研究［14］表明，Act1在右旋糖聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腸炎的發(fā)病中起重要作用。Chang等［15］研究表明，Act1調(diào)節(jié)IL-17依賴的NF-κB的活化，是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)子，介導(dǎo)從IL-17到NF-κB以及其他轉(zhuǎn)錄因子的活化。Li等［16］研究發(fā)現(xiàn)，Act1能激活NF-κB。Act1是介導(dǎo)和活化之間的唯一銜接蛋白［17］。

本研究發(fā)現(xiàn)，UC 腸黏膜中 Act1、IL-17、NF-κB p65的表達(dá)均上調(diào)，并隨UC病理分級(jí)的升高而表達(dá)升高，提示炎癥越重，Act1、IL-17、NF-κB p65表達(dá)越強(qiáng);Act1、NF-κB p65與IL-17呈正相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果表明，NF-κB p65是UC的發(fā)生、發(fā)展中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，與前期研究相同;提示Th17細(xì)胞在UC的發(fā)病中發(fā)揮重要的作用，推測(cè)該作用與增加IL-17分泌有關(guān);Act1在UC的發(fā)病中發(fā)揮重要的作用，推測(cè)這一作用可能通過(guò)介導(dǎo)IL-17信號(hào)，并進(jìn)一步活化NF-κB而實(shí)現(xiàn)，可能成為未來(lái)UC治療的潛在作用靶點(diǎn)。

［1］王龍，向永勝，蔣銳，等.美沙拉嗪聯(lián)合昆明海棠對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎臨床療效觀察［J］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2011，39(1):79-81.

［2］張?zhí)K閩，吳崑嵐，丁義江，等.氣藥灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床研究(附60例資料分析)［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2002，21(4):310-312.

［3］TRUELOVE S C，WITTE L J.Cortisone in ulcerative colitis.Final report on a therapeutic trial［J］.Br Med J，1955，2(4847):1041-1048.

［4］SCHROEDER K W，TREMAINE W J，HSTRUP D M.Coated oral 5-aminosalicylic acid therapy for mildly to moderately active ulceractive colitis.A randomized study［J］.N Engl J Med，1987，317:1625-1629.

［5］CHOW D K，LEONG R W，TSOI K K，et al.Long-term followup of ulcerative colitis in the Chinese population［J］.Am J Gastroenterol，2009，104(3):647-654.

［6］DAVID Q S，STEPHAN R T.Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease［J］.World J Gastroenterol，2008，14(3):390-400.

［7］SHIMAMOTO M，UENO Y，TANAKA S，et al.Selective decrease in colonic CD56(+)T and CD161(+)T cells in the inflamed mucosa of patients with ulcerative colitis［J］.World J Gastroenterol，2007，13(45):5995-6002.

［8］ANDRESEN L，JORGENSEN V L，PERNER A，et al.Activation of nuclear factor kappaB in colonic mucosa from patients with collagenous and ulcerative colitis［J］.Gut，2005，54:503-509.

［9］NARENDER N，RATNA P，SHAILENDRA G，et al.T-bet is essential for the progression of experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Immunology，2006，118(3):384-391.

［10］STASI R，Del POETA G，STIPA E，et al.Response to B-cell depleting therapy with rituximab reverts the abnormalities of T-cell subsets in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura［J］.Blood，2007，110(8):2824-2930.

［11］FUJINO S，ANDOH A，BAMBA S，et al.Increased expression of interleukin-17 in inflammatory bowel disease［J］.Gut，2003，52(10):65-70.

［12］SEIDERER J，ELBEN I，DIEGELMANN J，et al.Role of the novel Th17 cytokine IL-17F in inflammatory bowel disease(IBD):upregulated colonic IL-17F expression in active Crohn's disease and analysis of the IL17Fp.His161 Arg polymorphism in IBD［J］.Inflamm Boel Dis，2008，14(8):427-445.

［13］LINDEN A.A role for the cytoplasmic sdaptor protein Act1 in mediating IL-17 signaling［J］.Sci STKE，2007，398(4):1-47.

［14］QIAN Y，QIAN C，HARTUPEE J，et al.The adaptor Act1 is required for interleukin 17-dependent signaling associated with autoimmune and inflammatory disease［J］.Nat Immunol，2007，8(3):247-256.

［15］CHANG S H，PARK H，DONG C，et al.Actl adaptor protein is an immediate and essential signaling component of interleukin-17 receptor［J］.J Biol Chem，2006，281(47):35603-35607.

［16］LI X，COMMANE M，NIE H，et al.Act1，an NF-kappaB-activating protein［J］.Proc Natl Acad Sci，2000，97(19):10489-10493.

［17］KANAMORI M，KAI C，HAYASHIZAKI Y，et al.NF-kappaB actiator Act1 associates with IL-1/Toll pathway adaptor molecule TRAF6［J］.FEBS Lett，2002，532(2)，241-246.