應(yīng)用多重PCR方法鑒定蔬菜水果中的芽孢桿菌

岳鵬

（天津市食品研究所有限公司，天津 301609）

應(yīng)用多重PCR方法鑒定蔬菜水果中的芽孢桿菌

岳鵬

（天津市食品研究所有限公司，天津 301609）

摘 要：建立的多重PCR方法與16S rDNA序列作為模板對(duì)細(xì)菌的分型鑒定具有較好的特異性，可快速準(zhǔn)確鑒定芽孢桿菌的4個(gè)種屬，在微生物檢測(cè)方面有良好的實(shí)用前景。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌；多重PCR；16S rDNA

實(shí)驗(yàn)室最常見(jiàn)的檢測(cè)方法是根據(jù)菌體、菌落的特征和其生物化學(xué)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行鑒定。而面對(duì)表型特征不很明顯時(shí)很容易導(dǎo)致錯(cuò)判的現(xiàn)象，并且生化反應(yīng)耗時(shí)耗力，往往需要數(shù)天時(shí)間才能完成。目前開(kāi)發(fā)很多的試劑盒，如API和BIOLOG快速鑒定系統(tǒng)，測(cè)定步驟繁瑣、成本高不能夠滿(mǎn)足快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的需要。

1985年，Kary Mullis發(fā)明了PCR技術(shù)，PCR技術(shù)發(fā)展至今已延伸出很多不同種的變體，例如：遞減PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、熱啟動(dòng)PCR、即時(shí)PCR、巢式PCR、多重PCR等。PCR反應(yīng)是模仿細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過(guò)程，在體外由酶催化合成的特異性DNA片段。雙鏈DNA在高溫的作用下可以變性成單鏈，在有DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)DNA的溫度降低后又可以復(fù)性為雙鏈。因此，通過(guò)控制溫度的變化以達(dá)到DNA的變性和復(fù)性，加入合理設(shè)計(jì)的引物，DNA聚合酶和dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制[1]。近年來(lái)隨著核酸技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)16S rDNA常被用于細(xì)菌鑒定核糖體。16S rDNA基因序列全長(zhǎng)約1 550 bp，是由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成，利用保守段和可變段組成設(shè)計(jì)的引物，可以確定其菌屬以及同種菌屬不同菌株的類(lèi)別[2]。本文利用多重PCR技術(shù)，以最常見(jiàn)致病的芽孢桿菌為目的菌株，分離提純出其16S rDNA為模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中BLAST進(jìn)行序列的比對(duì)，確定其細(xì)菌的種屬。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

試驗(yàn)所用的蔬菜和水果選購(gòu)自市場(chǎng)；PCR套裝試劑盒（dNTPs、buffter、Taq 酶、Mg2+）：鑫國(guó)昌（北京）生物技術(shù)有限責(zé)任公司；限制性?xún)?nèi)切酶：郝佳（上海）科技發(fā)展有限公司；PCR引物的合成：杰瑞（北京）生物工程有限公司。

GeneAmp9700 PCR儀：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；低溫冷凍高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 方法與PCR體系的建立

1.2.1 芽孢桿菌的提取與提純

浸泡在7.5%氯化鈉溶液中，再加熱至90℃保持2 min，冷卻后制成幾個(gè)不同的10倍稀釋液，分別進(jìn)行平板涂布培養(yǎng)，分離的細(xì)菌經(jīng)過(guò)革蘭氏染色在顯微鏡下分離出芽孢桿菌23株（編號(hào)1-22）。

1.2.2 DNA的提取與提純

16S rDNA的提取。細(xì)菌經(jīng)24 h富集培養(yǎng)后，于5 500 r/min離心10 min，棄上清，沉淀物加入200 μL TE緩沖液、200 μL裂解液和0.5 g小玻璃珠，在振蕩器上以4 000 r/min的速度擊打1 min，反復(fù)3次。勻漿以12 000 r/min離心15 min，收集上清備用。上清液經(jīng)氯仿和70%乙醇洗滌數(shù)次，保存在-20℃的TE緩沖液中。提取出的DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)OD260/OD280進(jìn)行DNA的純度檢測(cè)。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系的建立

擬用40 μL的反應(yīng)體系，其中包括：0.2 μmol/L的特異性引物、3.75mmol/LMgCl2、200μmol/L 的 dNTP、5U Taq DNA聚合酶、1x PCR緩沖液和1 μg DNA模板。PCR引物模板選自文獻(xiàn)[3-4]中的特異性引物，見(jiàn)表1。

表1 特異性引物模板Table 1 Primers for specific PCR

PCR反應(yīng)循環(huán)為94℃1min；65℃90s，72℃2min；72℃for 10 min.反應(yīng)循環(huán)為35次。產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序

對(duì)擴(kuò)增的DNA序列測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果分析由BioEdit Sequence Alignment Editor（Version 7.0.5.3）軟件操作。測(cè)序結(jié)果與菌株之間的相似度比對(duì)由NCBI’s BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR產(chǎn)物的分析

以22株芽孢桿菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳在紫外燈下檢測(cè)結(jié)果顯示如圖1。

圖1 以22株芽孢桿菌的基因組DNA為模板的多重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The multiplex PCR amplification of other representative strains using 16s rDNA as template

PCR產(chǎn)物的大小由NCBI blast軟件完成預(yù)先的判定。B.subtilis的產(chǎn)物為256 bp、B.licheniformis的產(chǎn)物為356bp、B.pumilus為 321bp、B.cereus為 736bp。PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，1-5號(hào)為B.subtilis、13-18 號(hào)為B.licheniformis、19-22 號(hào)為B.pumilus、6-12號(hào)為B.cereus。限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI選擇用來(lái)對(duì)其中7、9、11號(hào)進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定其為B.cereus.結(jié)果經(jīng)由 NEB cutter 2.0（http：//tools.neb.com/NEBcutter2/index.php）軟件預(yù)測(cè)，其產(chǎn)物大小為兩段，分別為230 bp和599 bp。7、9、11號(hào)PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)物于1.2%凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 7、9、11號(hào)芽孢桿菌經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳圖Fig.2 PCR products after digested with restriction enzyme（EcoRI）.1.2%agarose gel

2.2 PCR產(chǎn)物的序列分析

對(duì)分離出的芽孢桿菌菌株的特異PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果通過(guò)GenBank中BLAST比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的同一區(qū)段核酸序列的同源性達(dá)到：枯草芽孢桿菌100%、地衣芽孢桿菌100%，蠟狀芽孢桿菌100%，結(jié)果說(shuō)明各特異性引物具有很強(qiáng)的保守性、特異性和忠實(shí)性。分離的22株芽孢桿菌分別為1-5號(hào)為B.subtilis、13-18 號(hào)為B.licheniformis、19-22 號(hào)為B.pumilus、6-12號(hào)為B.cereus。

3 結(jié)論

本文中用到的PCR方法可以為芽孢桿菌特別是蠟狀芽孢桿菌的檢測(cè)提供快速準(zhǔn)確的技術(shù)支持。雖然多重PCR方法在微生物檢測(cè)上做到快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，但是也有與其他一些芽孢菌發(fā)生交叉反應(yīng)的可能[5]以常規(guī)方法與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合，可取得事半功倍的效果。

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[1]楊文敏,何敏．PCR擴(kuò)增16S-23S rRNA區(qū)間序列在細(xì)菌檢測(cè)與鑒定領(lǐng)域的應(yīng)用[J]．廣西預(yù)防醫(yī)學(xué),2000,6(6):369

[2]Kolbert C P,Persing D H.Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens[J].Curr Opin Microbiol,1999,2(3):299-305

[3]Kolusheva T,Marinova A.A Study of the Optimal conditions for starch hydrolysis through thermostable α-AMYLASE[J].Journal of the university of chemical technology and metallurgy,2007,42(1):93-96

[4]曹鳳明,沈德龍,李俊,等.應(yīng)用多重PCR鑒定微生物肥料常用芽孢桿菌[J].微生物學(xué)報(bào),2008,48(5):651-656

[5]Buchanan R E,Gibbons N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].8版.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組，譯.北京:科學(xué)出版社,1984:78-88

Application of Muti-PCR for Identification of Bacillus spp.in Vegetable and Fruit

YUE Peng
（Institute of Tianjin Food Co.，LTD.，Tianjin 301609，China）

Abstract：The rapid and accurate method established with multiplex PCR with high specificity as a template using 16S rDNA sequence for identification of the fourBacillus spp.

Key words：Bacillus spp.；Muti-PCR；16S rDNA

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.027

岳鵬（1985—），男（漢），助理工程師，碩士，從事微生物PCR鑒定工作。

2013-06-18