王海東，金芳梅，王淑萍

(1.甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅蘭州730050;2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅蘭州730050;3.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一種全身代謝性骨骼疾病，以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，表現(xiàn)為骨板變薄、多孔，骨小梁變細(xì)、斷裂、稀少，骨顯微結(jié)構(gòu)的完整性受損、連接性降低，導(dǎo)致骨強(qiáng)度降低，骨脆性增加，極易發(fā)生骨折［1］。目前，全世界約有2億人患骨質(zhì)疏松癥，其社會(huì)發(fā)病率已躍居世界各種常見(jiàn)病的第7位，被稱(chēng)為悄無(wú)聲息的流行病。嘛呢骨痹膠囊來(lái)源于藏區(qū)民間治療頸肩腰腿痛的驗(yàn)方，方中中、藏藥結(jié)合，功效補(bǔ)腎溫陽(yáng)、活血壯骨。前期的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究顯示:該藥可使大鼠軟骨膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞增生，且細(xì)胞體變大，骨小梁明顯增寬，顯示該藥可使大鼠骨化作用增強(qiáng)［2］。本實(shí)驗(yàn)旨在探討嘛呢骨痹膠囊對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠血清Ca、P水平，尿脫氧吡啶酚(deoxypyridinoline，DPD)和尿肌酐(creatinine，Cr)比值(DPD/Cr)的影響，研究嘛呢骨痹膠囊增治療骨質(zhì)疏松的作用及機(jī)制，為該藥的臨床運(yùn)用提供理論依據(jù)，同時(shí)豐富中醫(yī)腎主骨的理論。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雌性大鼠72只，體質(zhì)量(200±20)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(甘)2010－0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

嘛呢骨痹膠囊，由中藥補(bǔ)骨脂、懷牛膝、杜仲、續(xù)斷、烏梢蛇及藏藥巴羅、休布、水柏枝等藥物組成，批號(hào)為甘衛(wèi)普制準(zhǔn)字(98)332－14號(hào)，由甘肅中醫(yī)藥研究院制劑室提供;結(jié)合雌激素，0.625 mg/片，愛(ài)爾蘭惠氏藥廠產(chǎn)品，由江蘇惠氏制藥有限公司分包裝，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)為BH20050498，分包裝批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字J 20050120;戊巴比妥鈉，上?；瘜W(xué)試劑公司提供，批號(hào)F20091924。鈣測(cè)定試劑盒(30T，批號(hào)為 20110627，20110706，20110708)，無(wú)機(jī)磷測(cè)定試劑盒(100T/96樣，批號(hào)為20110627)，血、尿Cr測(cè)定試劑盒(100T/96樣，批號(hào)20110706)，均由南京建成生物工程研究所提供;脫氧吡啶酚酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(96T)，美國(guó) RD公司產(chǎn)品，批號(hào)E11070609。BP211D型電子天平，瑞士Sartorius公司產(chǎn)品;UV－2401PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品;DZW－4型恒溫水浴鍋，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品;PLCO型臺(tái)式低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立與分組

將72只大鼠按體質(zhì)量編號(hào)后以隨機(jī)數(shù)字表法抽取12只為假手術(shù)組(手術(shù)切除卵巢周?chē)窘M織)，其余60只為手術(shù)組(切除雙側(cè)卵巢，使大鼠骨質(zhì)疏松模型形成)。將造模成功的60只大鼠隨機(jī)分為結(jié)合雌激素組、模型對(duì)照組和嘛呢骨痹膠囊低、中、高劑量組5組。大鼠手術(shù)后7 d開(kāi)始灌胃治療。嘛呢骨痹膠囊低、中、高劑量組每天分別以0.337 5，0.675 0，1.350 0 mg/g體質(zhì)量灌胃給藥;結(jié)合雌激素組每天以0.01 μg/g體質(zhì)量灌胃給藥，假手術(shù)組與模型對(duì)照組給予等量生理鹽水，連續(xù)12周。每周稱(chēng)體質(zhì)量1次，重新計(jì)算給藥量。灌胃治療12周后，密切觀察動(dòng)物的精神狀態(tài)、毛色、進(jìn)食、體質(zhì)量變化，以及傷口有無(wú)感染跡象。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

標(biāo)本采集:最后1次灌胃治療后，所有實(shí)驗(yàn)大鼠均禁食不禁水24 h，置代謝籠中，收集24 h尿液并置－20℃冰箱中保存，集中檢驗(yàn)。尿液收集，稱(chēng)量大鼠體質(zhì)量;以30 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(按100 g體質(zhì)量0.15 mL給藥);股動(dòng)脈取血并斷頭處死大鼠，將血液在室溫下靜置1～2 h，使其充分凝固，以1500 r/min離心30 min，吸取上部清亮的血清于－20℃冰箱內(nèi)保存以檢測(cè)血Ca、血P水平。血Ca、血P、尿Cr水平按試劑盒說(shuō)明書(shū)使用紫外分光光度儀測(cè)定;尿DPD按照大鼠Elisa－脫氧吡啶酚試劑盒說(shuō)明書(shū)操作后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與模型對(duì)照組對(duì)比，嘛呢骨痹膠囊高劑量組血Ca水平升高，尿DPD/Cr比值降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);嘛呢骨痹中、低劑量組Ca水平升高，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);嘛呢骨痹膠囊低、中、高劑量可升高去卵巢大鼠的血磷水平，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與結(jié)合雌激素組對(duì)比，嘛呢骨痹膠囊高、中劑量組血Ca、血和尿DPD/Cr比值差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。結(jié)果提示:嘛呢骨痹膠囊通過(guò)抑制骨吸收可有效抑制骨質(zhì)疏松癥骨量的丟失，其治療效果與結(jié)合雌激素相當(dāng)，且治療效果與劑量相關(guān)，有效劑量為中等劑量以上。

表1 各組大鼠血Ca、血P水平及尿DPD/Cr比值對(duì)比 ±s

表1 各組大鼠血Ca、血P水平及尿DPD/Cr比值對(duì)比 ±s

注:與假手術(shù)組對(duì)比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型對(duì)照組對(duì)比，#P＜0.05，##P＜0.01;與結(jié)合雌激素組對(duì)比，△ P＜0.05，△△ P＜0.01。

組 別 動(dòng)物數(shù) 血Ca/mmol·L－1 血P/mmol·L－1DPD/Cr假手術(shù)組12 2.49±0.36 2.24±0.34 4.39±1.00模型對(duì)照組 11 2.14±0.50＊△ 1.82±0.40＊＊△△ 8.22±2.07＊＊△△結(jié)合雌激素組 11 2.50±0.39# 2.10±0.28*## 4.37±1.42##嘛呢骨痹膠囊高劑量組 11 2.59±0.27## 2.05±0.25 3.72±1.10##嘛呢骨痹膠囊中劑量組 12 2.41±0.41 1.90±0.31＊＊ 5.64±1.59##嘛呢骨痹膠囊低劑量組 12 2.34±0.45 1.76±0.25＊＊△ 6.80±2.77＊＊△△

3 討論

骨的強(qiáng)度由骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡決定，骨吸收增加或骨形成減少都將打破這個(gè)平衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。在骨代謝指標(biāo)中，骨吸收指標(biāo)較骨生成指標(biāo)更為準(zhǔn)確和靈敏，對(duì)骨質(zhì)疏松的診斷顯得更有意義［3－4］。骨是人體中 Ca、P的最大儲(chǔ)庫(kù)，通過(guò)成骨與溶骨作用不斷與細(xì)胞外液進(jìn)行鈣磷交換，以維持血Ca和血P的平衡。體內(nèi)P 85%存在于骨中，其主要作用是促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和骨礦沉積，血中Ca、P含量反應(yīng)骨吸收，影響骨吸收速率，血中Ca、P的穩(wěn)定是骨生長(zhǎng)和礦化的必要條件。近年來(lái)，尿吡啶酚(PYD)和DPD的測(cè)定被認(rèn)為是目前反映骨吸收最敏感且特異性很強(qiáng)的指標(biāo)。前者廣泛分布于骨、軟骨、牙齒、肌腱、韌帶和主動(dòng)脈等成熟的膠原纖維中;后者是骨的特異性標(biāo)志物，僅在骨骼Ⅰ型膠原中有相當(dāng)量的存在，破骨細(xì)胞活動(dòng)時(shí)作為Ⅰ型膠原纖維降解產(chǎn)物，以游離或肽結(jié)合形式釋放入血，從尿中排出，不受飲食影響，具有骨特異性［5－6］。

中醫(yī)理論認(rèn)為:骨質(zhì)疏松病因主要責(zé)之以腎虛，并與脾虛、氣血生化不足存在密切相關(guān)，肝虛血瘀亦是骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展的促進(jìn)因素。腎虛是骨質(zhì)疏松發(fā)病的關(guān)鍵，而在腎虛的表現(xiàn)中，腎陽(yáng)虛尤為顯著。腎陽(yáng)為全身之元陽(yáng)，對(duì)機(jī)體臟腑、組織起溫煦作用，維持臟腑、組織發(fā)揮正常生理功能。腎陽(yáng)的盛衰關(guān)系著骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育，腎陽(yáng)虧虛，則筋骨失去正常溫煦，筋枯髓減而致骨痿;腎陽(yáng)虛衰可使推動(dòng)、激活功能減弱，導(dǎo)致臟腑、經(jīng)絡(luò)等組織器官的生理活動(dòng)減弱;腎陽(yáng)虛衰日久，氣化失職，血液運(yùn)行不利，甚則寒凝血瘀，脈道拘急，造成瘀血阻滯，經(jīng)脈不暢;骨骼及其周?chē)M織因瘀血阻滯而得不到濡養(yǎng)，則發(fā)為骨質(zhì)疏松。中醫(yī)學(xué)自古就有“久病入絡(luò)”“因虛致瘀”的說(shuō)法。嘛呢骨痹膠囊組方中補(bǔ)骨脂、懷牛膝為君藥，溫補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋壯骨;杜仲、續(xù)斷為臣藥，助君藥補(bǔ)腎壯骨，舒筋活絡(luò);佐以烏梢蛇疏通經(jīng)絡(luò)，木香行氣活血，藏藥巴羅、休布活血通絡(luò);使以水柏枝宣透內(nèi)濕，以消關(guān)節(jié)痹痛。全方組方嚴(yán)謹(jǐn)，諸藥相伍，通達(dá)內(nèi)外，標(biāo)本互應(yīng)，使溫陽(yáng)補(bǔ)腎而不燥，活血通絡(luò)而不過(guò)，既補(bǔ)腎溫陽(yáng)，又活血通絡(luò)壯骨，使氣血和、精髓充，骨骼得到充養(yǎng)而剛強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示:在血Ca方面，嘛呢骨痹膠囊能明顯升高去卵巢大鼠的血Ca濃度，并能使去卵巢大鼠的血Ca濃度維持甚至高于正常水平，其中以嘛呢骨痹膠囊高劑量組作用最明顯，甚至優(yōu)于結(jié)合雌激素;在血P方面，嘛呢骨痹膠囊能明顯升高去卵巢大鼠的血磷水平，但效果弱于結(jié)合雌激素;在尿DPD/Cr方面，嘛呢骨痹膠囊能降低去卵巢大鼠尿DPD/Cr，且有明顯的量效關(guān)系，并有優(yōu)于結(jié)合雌激素的趨勢(shì)。綜合分析表明:嘛呢骨痹膠囊能升高血Ca、血P水平，降低尿DPD/Cr。通過(guò)降低骨吸收來(lái)預(yù)防OP，可能為腎主骨作用機(jī)制之一。

［1］肖建德，閻德文，王大平，等.實(shí)用骨質(zhì)疏松學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2004.

［2］王海東，李長(zhǎng)天.嘛呢骨痹液對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠創(chuàng)傷性骨痹作用的研究［J］.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，19(3):5 －7.

［3］肖恩.骨質(zhì)疏松骨代謝生化指標(biāo)的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2008，14(3):212 －214.

［4］Prestwood KW，Thomprson DL，Kenny AM，et a1.Low dose estrogen and calcium have an additive effect on bone resorption in older women［J］.J Clin Endocrinol Metab，1999，84(1):179－183.

［5］Eyre DR，Dickson IR，Van Ness K，et al.Collagen cross－linking in humanbone and articular cartilage.Age－related changes in the content of maturehydroxypyridinium residues［J］.Biochem J，1988，252(2):459 －500.

［6］Delmas P.Clinical usefulness of biochemical marker of bone remodelingin osteoporosis［J］.Rew Prat，1995，45(9):1102.