鐮形棘豆總黃酮對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞增殖的研究*

王曉紅，楊曉云，李 欽，楊麗霞，李曉東，姜 華

(1．嘉峪關(guān)市第一人民醫(yī)院，甘肅 嘉峪關(guān)735100; 2．甘肅省中醫(yī)學(xué)校，甘肅 蘭州730050;3．甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州730050)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最為常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，嚴(yán)重威脅著糖尿病患者的生命。在美、日和歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，DN 已成為終末期腎臟疾病的首位病因(約占35%)和糖尿病患者死亡的主要原因，在我國(guó)DN 發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)［1］。目前，DN 的發(fā)病機(jī)制尚未明確。既往認(rèn)為DN 的早期病變部位在腎小球，近年來研究發(fā)現(xiàn)腎小管病變及腎間質(zhì)纖維化的程度與腎功能的相關(guān)性更為密切，故腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制在DN 的發(fā)展中越來越受到人們的重視［1］。細(xì)胞增殖是組織器官發(fā)生纖維化的病理改變之一，一般發(fā)生在纖維化形成初期，因此，為了早期預(yù)防纖維化的發(fā)展，抑制細(xì)胞增殖顯得至關(guān)重要。鐮形棘豆總黃酮是甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所提取分離的鐮形棘豆的有效組分。前期研究［2－3］表明:鐮形棘豆藥材氯仿提取物、總黃酮苷元及主要黃酮化合物具有較強(qiáng)的抑菌、抗炎、抗氧化的作用。目前大量研究表明:植物黃酮類化合物在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面具有顯著療效［4－6］，蕎麥花葉總黃酮、玉米須總黃酮、葛根黃酮等黃酮苷藥物具有降血糖、改善胰島素抵抗的的功效，有些已應(yīng)用于臨床［7－9］。為了進(jìn)一步探討鐮形棘豆總黃酮的藥理作用，本課題研究了鐮形棘豆總黃酮干預(yù)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1(TGF-β1)誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)(HK-2)胞增殖情況，為其防治DN 腎纖維化的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng) 物

SPF 級(jí)Wistar 大鼠24 只，雄性，體質(zhì)量(200 ±20)g，購(gòu)于甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(甘)2004-0006。普通飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)于蘭州軍區(qū)總醫(yī)院屏障級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào):SYXK-(軍)2007-022。

1．2 細(xì)胞株

HK-2 購(gòu)自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。

1．3 藥品、試劑與儀器

鐮形棘豆總黃酮，由甘肅省中醫(yī)藥研究院中藥研究所提供。DMEM/F12(1∶1)細(xì)胞培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco 公司;胎牛血清，購(gòu)自Hyclon 公司;MTT、EDTA、胰蛋白酶、DMSO，均購(gòu)自Amresco 公司;人重組TGF-β1，R＆D System，產(chǎn)地美國(guó)，根據(jù)說明書，用含1 g /L 牛血清白蛋白的無菌弱HCl(4 mM)配制為1 ng/L 的儲(chǔ)存液，無菌EP 管－70 ℃儲(chǔ)存，用時(shí)配成10 pg/L 濃度［10］。HEAL CELL HL90 二氧化碳培養(yǎng)箱，香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司產(chǎn)品;BSC－1000IIA2 生物潔凈安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品;Olympus X－71 倒置顯微鏡，產(chǎn)地日本;CliniBio 128L－400 酶標(biāo)儀，產(chǎn)地奧地利。

1．4 鐮形棘豆總黃酮藥物血清制備

將24 只大隨機(jī)分為空白組、藥物組(鐮形棘豆總黃酮)2 組，每組12 只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，藥物組按300 μg/g 給大鼠灌胃，空白組灌服同體積生理鹽水，每次10 μL/g 體質(zhì)量，2 次/d，連續(xù)灌胃3 d。于末次灌胃前8 h 禁食不禁水;末次灌胃30 min 后，大鼠股動(dòng)脈無菌采血;靜置2 h，3000 r/min 冷凍離心20 min，取上清;將同組血清混合，56 ℃水浴滅活30 min，－20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

HK-2 細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈 霉素DMEM/F12(1∶1)完全培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2～3 d 換新鮮培養(yǎng)基1 次，培養(yǎng)融合至80 % 以上，用含2．5 g/L 胰蛋白酶、0．5 g/L EDTA 的消化液消化，用完全培養(yǎng)基終止消化后，1000 r/min 離心5 min。用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前先用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞同步化，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。傳代培養(yǎng)的HK-2 細(xì)胞分為以下4 組:①空白對(duì)照組:DMEM/F12 培養(yǎng)液。②單純TGF-β 誘導(dǎo)組:DMEM/F12 培養(yǎng)液+ 10 μg/L TGF-β1。③空白血清對(duì)照組:DMEM/F12 培養(yǎng)液+10 μg/L TGF-β1+ 體積分?jǐn)?shù)10%空白血清。④干預(yù)組:DMEM/F12 培養(yǎng)液+10 μg/L TGF-β1+體積分?jǐn)?shù)10%鐮形棘豆總黃酮藥物血清。

1．6 檢測(cè)指標(biāo)

1．6．1 細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞以1．5 ×105個(gè)/mL 密度接種于6 孔板，每孔2 mL，每組2 個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱培養(yǎng)過夜。吸棄細(xì)胞上清，加入無血清培養(yǎng)基2 mL 靜止24 h，使其同步化。棄細(xì)胞上清，按分組加入相應(yīng)藥品2 mL，對(duì)照組加入培養(yǎng)基2 mL。孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照。

1．6．2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

細(xì)胞以3 ×104個(gè)/mL 密度接種于96 孔板，每孔100 μL，每組5 個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱培養(yǎng)過夜。吸棄細(xì)胞上清，加入無血清培養(yǎng)基100 μL 靜止24 h，使其同步化。棄細(xì)胞上清，按分組加入相應(yīng)藥品100 μL，對(duì)照組加入培養(yǎng)基100 μL，分別在24，48，72 h 時(shí)各取出1 板，棄培養(yǎng)上清液，加入1 g/L MTT 100 μL 孵育4 h。棄上清，加入DMSO 100 μL，左上角孔中加入100 μL DMSO作為“調(diào)0 孔”，振蕩10 min 使藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解，在酶標(biāo)儀上492 nm 處測(cè)定吸光A 值。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13．0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，進(jìn)行單因素方差分析(Oneway ANOVA)。以P＜0．05 為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 鐮形棘豆總黃酮對(duì)HK-2 細(xì)胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察顯示:正常狀態(tài)下，HK-2 呈鋪路石樣貼壁生長(zhǎng)。經(jīng)10 μg/L TGF-β1誘導(dǎo)后，細(xì)胞變長(zhǎng)呈梭形，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞整體呈現(xiàn)纖維樣生長(zhǎng)，但與鐮形棘豆總黃酮藥物血清共同干預(yù)后，細(xì)胞的纖維樣狀態(tài)變化不明顯，而空白血清無此作用。見圖1。

圖1 鐮形棘豆總黃酮對(duì)HK-2 細(xì)胞形態(tài)的影響

2．2 鐮形棘豆總黃酮對(duì)HK-2 細(xì)胞增殖的影響

MTT 法檢測(cè)結(jié)果顯示:HK-2 細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后增殖明顯，與空白對(duì)照組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，且細(xì)胞增殖具有顯著的時(shí)間依賴性;但經(jīng)過與鐮形棘豆總黃酮藥物血清共同干預(yù)，細(xì)胞增殖在一定程度上受到抑制，與單純TGF-β1誘導(dǎo)組對(duì)比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，而空白血清無此作用。見表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組HK-2 細(xì)胞增殖情況對(duì)比吸光值A(chǔ)492 nm，n=6，±s

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組HK-2 細(xì)胞增殖情況對(duì)比吸光值A(chǔ)492 nm，n=6，±s

注:與空白對(duì)照組對(duì)比，* P ＜0．05;與單純TGF-β1 誘導(dǎo)組對(duì)比，# P ＜0．05。

A 24h A 48h A 72h空白對(duì)照組 0．247±0．004# 0．291±0．004# 0．311±0．003組 別#單純TGF-β1 誘導(dǎo)組 0．287±0．005* 0．343±0．009* 0．362±0．006*空白血清對(duì)照組 0．287±0．005* 0．346±0．008* 0．358±0．005*干預(yù)組 0．263±0．004# 0．315±0．003# 0．332±0．015#

3 討 論

DN 時(shí)腎小管病變可發(fā)生在腎小球病變之前、之后或同時(shí)發(fā)生。病變初期表現(xiàn)為腎小管基底膜增厚、小管數(shù)目增加及小管肥大，后期發(fā)生腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化。腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)［11］。多年研究證明:TGF-β 超表達(dá)是腎纖維化形成的關(guān)鍵因子。TGF-β超表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞增殖，而細(xì)胞增殖是組織器官發(fā)生纖維化的病理改變之一，一般發(fā)生在纖維化形成初期，是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生的主要來源，而ECM 過度沉積是纖維化病變的主要特征［12］。目前，許多研究已將TGF-β 作為研究腎小管上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的經(jīng)典誘導(dǎo)因子。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對(duì)腎間質(zhì)纖維化的防治措施主要有使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑、TGF-β1中和抗體或天然拮抗劑、基因治療等諸多方面，但其抗腎纖維化效果并不理想。近年來，中醫(yī)藥從扶正固本、活血化瘀、清熱利濕、化濁排毒等多個(gè)角度，從單味中藥、中藥有效成分及中藥復(fù)方制劑多個(gè)方面進(jìn)行抗纖維化的實(shí)驗(yàn)及臨床研究，取得了一定的進(jìn)展［13－14］。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):鐮形棘豆總黃酮在一定程度上具有抑制TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞增殖的作用。顯微鏡下觀察顯示:鐮形棘豆總黃酮能預(yù)防TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞的纖維樣改變，在一定程度上維持了細(xì)胞形態(tài)的穩(wěn)定性。MTT 檢測(cè)顯示:鐮形棘豆總黃酮能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞增殖，在一定程度上預(yù)防了早期纖維化的形成。

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