柴川，于生，崔小兵，張愛華，朱棟，單晨嘯，文紅梅

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210029）

靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用分析淡豆豉中揮發(fā)性成分

柴川，于生，崔小兵，張愛華，朱棟，單晨嘯，文紅梅*

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210029）

摘 要：采用自動化靜態(tài)頂空（HS）-氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對6個批次淡豆豉的揮發(fā)性成分進(jìn)行快速分析鑒定。從測定到的40多種成分中確定了2-丁酮、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、香芹烯等11種共有化合物及2，3，5-三甲基吡嗪、L-乙酸冰片酯、古巴烯、四甲基吡嗪等16種非共有化合物；同時使用峰面積歸一化法計算了27種揮發(fā)性成分的相對含量，各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定差異。研究表明，使用自動化靜態(tài)頂空氣質(zhì)聯(lián)用法測定淡豆豉的揮發(fā)性成分快速簡便，且在一定程度上促進(jìn)了淡豆豉揮發(fā)性成分的指紋圖譜構(gòu)建，為淡豆豉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考。

關(guān)鍵詞：淡豆豉；揮發(fā)性成分；自動化靜態(tài)頂空；氣質(zhì)聯(lián)用

豆豉是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品，按其發(fā)酵方式不同可分為咸豆豉與淡豆豉，咸豆豉是一種豆制食品，無明顯藥用價值；而淡豆豉則是收錄于《中國藥典》的一味中藥，具有解表、除煩，宣發(fā)郁熱的功效。豆豉具有揮發(fā)性成分，能產(chǎn)生特殊的香氣，可以增強食欲，促進(jìn)吸收，常作為發(fā)酵調(diào)味品，國內(nèi)外研究者運用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析了咸豆豉中揮發(fā)性成分[1-5]，而淡豆豉中揮發(fā)性成分未見文獻(xiàn)報道。

近年來，頂空分析方法逐漸成為分析工作者研究揮發(fā)性成分的重要手段，其中自動化靜態(tài)頂空方法最為常用，此法針對揮發(fā)性較強的成分，直接采集樣品上方氣體，可以避免基體成分對樣品分析的影響[6]，相對于靈敏度高而操作復(fù)雜負(fù)責(zé)的動態(tài)頂空而言，更適合研究者對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的考察。

本研究首次采用自動化靜態(tài)頂空（HS）與氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）相結(jié)合的方法對淡豆豉藥材的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性定量分析，并對不同批次淡豆豉的揮發(fā)性成分進(jìn)行比較，以建立檢測分析淡豆豉揮發(fā)性成分的快速便捷的方法，從而促進(jìn)淡豆豉揮發(fā)性成分的指紋圖譜構(gòu)建，為淡豆豉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及藥用價值的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藥材采自安徽、江蘇、河南三地見表1，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為淡豆豉藥材。

表1 6個批次的淡豆豉藥材信息Table 1 Information about 6 batches of semen sojae Preparatum

1.2 儀器設(shè)備

6890/5975B型氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國Agilent公司，G1701DAD.03.00.611工作站，G1888頂空自動進(jìn)器，NIST05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜檢索庫；高速萬能粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供試品制備

將淡豆豉藥材粉碎，過80目篩后，密閉保存?zhèn)溆?；精密稱取藥材粉末4 g于10 mL頂空裝樣瓶；每一批材料平行準(zhǔn)備三份。

1.3.2 儀器條件

色譜條件：色譜柱為美國Agilent公司DB-5 MS（0.25 mm×30 m×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為 180℃；載氣為高純氦氣；流速1 mL/min；分流比為20︰ 1；程序升溫初始溫度為50℃，1℃/min升至60℃，5℃/min升至100℃，25℃/min升至240℃，維持10 min，總分析時間48 min。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI離子源，電子能量70eV；離子源溫度為230℃，四級桿溫度為150℃，接口溫度為280℃；掃描范圍為50 amu～600 amu；電子倍增器電壓為1 342 V。

頂空分析條件：柱箱溫度為80℃，定量管溫度為95℃，傳輸線溫度為110℃，樣品瓶平衡時間為40 min，樣品瓶加壓時間為0.15 min，定量環(huán)填充時間為0.15 min。

1.3.3 頂空分析條件的考察

樣品量的影響：選取2 g（約10 mL頂空瓶1/4體積）、4 g（約 10 mL頂空瓶 1/2體積）、6 g（約 10 mL頂空瓶3/4體積）3種樣品量，分別置于10 mL頂空瓶中，平衡溫度100℃，平衡時間30 min，頂空進(jìn)樣分析。

頂空平衡溫度的影響：在對頂空平衡溫度進(jìn)行優(yōu)化的過程中，平衡時間固定為30 min，將平衡溫度分別設(shè)定為 40、60、80、100 ℃。

頂空平衡時間的影響：將淡豆豉的頂空平衡溫度固定在80℃，平衡時間分別設(shè)定為20、40、60 min，研究不同的頂空平衡時間對實驗的影響。

1.3.4 定性與定量方法

定性分析方法：取淡豆豉藥材（批號101031）4 g，平行測定3次。依據(jù)GC-MS總離子流圖，將各色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜信息進(jìn)行人工解析并與NIST05圖庫檢索中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照，匹配度≥80視為鑒定出的揮發(fā)性成分。

定量分析方法：取淡豆豉藥材（批號101031）4 g，平行測定3次。用峰面積歸一化法計算實驗所得化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 頂空分析條件的考察

影響自動化靜態(tài)頂空效率的主要因素有樣品量、平衡溫度和平衡時間等。樣品量的多少會影響頂空瓶內(nèi)揮發(fā)性成分的濃度及檢測效果；過高的平衡溫度或過長的平衡時間都有可能導(dǎo)致熱降解等反應(yīng)或引起一些性質(zhì)不穩(wěn)定的揮發(fā)性成分會發(fā)生熱分解、氧化等反應(yīng)，使得分析靈敏度降低[7]。

2.1.1 樣品量的影響

頂空進(jìn)樣分析結(jié)果表明，樣品量為4 g時測到的揮發(fā)性成分豐度最大。最終選擇樣品量4 g為最佳樣品量，置于10 mL頂空瓶中測定淡豆豉揮發(fā)性成分。

2.1.2 頂空平衡溫度的影響

頂空進(jìn)樣分析結(jié)果表明，平衡溫度升高，淡豆豉釋放出來的揮發(fā)性成分的數(shù)量與豐度都隨之增多，當(dāng)平衡溫度在100℃時揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量與豐度都與80℃無明顯區(qū)別。最終選擇80℃為淡豆豉最佳頂空平衡時間。

2.1.3 頂空平衡時間的影響

頂空進(jìn)樣分析結(jié)果表明，隨頂空平衡時間的延長，淡豆豉釋放出來的揮發(fā)性成分增多，在40 min以前，揮發(fā)性成分的數(shù)量與豐度都隨時間的延長而增加；40min以后，揮發(fā)性成分已無太大變化。綜合考慮效果與效率，選擇40 min為淡豆豉最佳頂空平衡時間。

2.2 分析方法精密度的考察

平行測定3次結(jié)果（表2）表明，色譜圖中16個主要色譜峰的保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0%～0.16%，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.27%～5.29%。

表2 6個批次淡豆豉藥材中27種揮發(fā)性成分及其含量測定結(jié)果Table 2 The 27 volatile components identified in the 6 batches of semen sojae Preparatum and the quantitative results

2.3 揮發(fā)性成分的GC/MS分析

由淡豆豉揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流圖（圖1）可見，將各色譜峰對應(yīng)的質(zhì)譜圖進(jìn)行人工解析及計算機檢索（NIST05），從6個批次藥材中檢出近40個色譜峰，從中鑒定出了27種揮發(fā)性成分（NIST05匹配度≥80），表3將其分為醛類化合物、醇類化合物、酮類化合物、醚類化合物、烴類化合物、酸類化合物、含硫化合物、含氮雜環(huán)化合物、酯類化合物、酚類化合物，其中乙醛、甲硫醇、乙醇、丙酮、二甲基乙醛、2-丁酮、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、二甲基二硫、香芹烯、3，7-二甲基-1，6-二丙烯基苯酚共11種化合物是6個批次藥材的共有揮發(fā)性成分；而二氯甲烷、乙酸、2，3-丁二醇、戊烯醇、1-甲基-4-（1-甲基乙基）-1，4-環(huán)己二烯、正己醛、2，3-二甲基吡嗪、雙乙酰、二甲基二硫醚、二甲基硫醚、樟腦、2，3，5-三甲基吡嗪、L-乙酸冰片酯、古巴烯、四甲基吡嗪、7H-呋喃[3，2-g][1]苯并吡喃-7-酮共16種化合物能在部分批次中檢測到。這27種化合物有些在豆豉、黃豆醬、醬油、腐乳等大豆發(fā)酵物中檢出[3，8-12]，而大部分化合物，如香芹烯、L-乙酸冰片酯、古巴烯等，暫未被文獻(xiàn)報道，本研究認(rèn)為引起大豆發(fā)酵物種揮發(fā)性成分差異的因素是多方面的，而發(fā)酵方式及輔料的差異從根本上導(dǎo)致了揮發(fā)性成分的差異；這些揮發(fā)性成分的發(fā)現(xiàn)都為進(jìn)一步研究淡豆豉藥材提供了基礎(chǔ)，有待與藥理學(xué)相結(jié)合進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 淡豆豉GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram（TIC）of Semen Sojae Praepatum by GC-MS

2.4 定量分析

表3同時列出了6個批次藥材揮發(fā)性成分的保留時間和峰面積相對含量，觀察共有峰面積的統(tǒng)計結(jié)果，不同批次藥材的各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定程度的差異，例如從藥材揮發(fā)性成分的種類來看，河南產(chǎn)多于安徽產(chǎn)和江蘇產(chǎn)；而不同貯藏時間揮發(fā)性成分的種類和含量也存在差異。

表3 淡豆豉測定方法的精密度考察結(jié)果Table 3 The precision of the 16 volatile components identified in the semen sojae Preparatum

3 結(jié)論

本研究從鑒定出成分種類和含量方面均能表明，自動化靜態(tài)頂空氣質(zhì)聯(lián)用法此方法可以快速、簡便、準(zhǔn)確地對淡豆豉中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量，在一定程度上彌補了現(xiàn)階段對淡豆豉揮發(fā)性成分研究的空白，同時促進(jìn)了淡豆豉藥材揮發(fā)性成分的指紋圖譜構(gòu)建，為淡豆豉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了參考；由于發(fā)酵方式及輔料的不同，實驗所檢測出的揮發(fā)性成分有異于其他的大豆發(fā)酵物質(zhì)；由于不同來源及不同的采收期、加工方式、存儲方式，不同批次淡豆豉藥材中的揮發(fā)性成分含量也不盡相同[13]，要建立出完整的對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有指導(dǎo)意義的淡豆豉頂空氣相指紋圖譜，還有待后續(xù)對產(chǎn)地、采收時間及加工工藝等條件的研究。

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[1]Leejeerajumnean A,Duckham S C,Owens J D,et al.Volatile compounds in Bacillus-fermented soybeans[J].Journal of the science of food and agriculture,2001,81(5):525-529

[2]余愛農(nóng),楊春海.細(xì)菌型豆豉香氣成分的研究[J].食品科學(xué),2002,23(12):98-100

[3]黃紅霞,孟鴛,康旭,等.頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析傳統(tǒng)豆豉中的揮發(fā)性成分[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2010,22(9):25-29

[4]秦禮康,丁霄霖.傳統(tǒng)陳窖豆豉粑和霉菌型豆豉揮發(fā)性風(fēng)味化合物研究[J].食品科學(xué),2005,26(8):275-280

[5]范琳,陶湘林,歐陽晶,等.曲霉型豆豉后發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分的動態(tài)變化研究[J].食品科學(xué),2012,33(22):274-277

[6]譚和平,李斌,張云嫦,等.自動化靜態(tài)頂空-氣質(zhì)聯(lián)用法測定茶葉香氣[J].中國測試,2009,35(4):62-64

[7]廖遠(yuǎn)熹,王昊陽,郭寅龍,等.中藥柴胡揮發(fā)性成分的自動化靜態(tài)頂空-氣相色譜-質(zhì)譜分析[J].質(zhì)譜學(xué)報,2005,26(3):187-192

[8]喬鑫,付雯,喬宇,等.豆醬揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析[J].食品科學(xué),2011,32(2):222-226

[9]趙建新,戴小軍,田豐偉,等.氣相-嗅聞法分析傳統(tǒng)豆醬風(fēng)味活性物質(zhì)[J].食品科學(xué),2009(20):394-397

[10]嚴(yán)留俊,張艷芳,陶文沂,等.頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法快速測定醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味成分[J].色譜,2008,26(3):285-291

[11]黃明泉,孫寶國,陳海濤,等.同時蒸餾萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)機分析北京地區(qū)紅腐乳揮發(fā)性成分的研究[J].食品工業(yè)科技,2010(7):150-153

[12]王林祥,劉楊岷,王建新.醬油風(fēng)味成分的分離與鑒定[J].中國調(diào)味品,2005(1):45-47

[13]于生,單鳴秋,池玉梅,等.貓爪草藥材頂空氣相色譜指紋圖譜研究[J].江蘇中醫(yī)藥,2007,39(4):47-48

Analysis of Volatile Components in Semen Sojae Praepatum with Automatic Static Headspace and Gas Chromatography-Mass Spectrometry

CHAI Chuan，YU Sheng，CUI Xiao-bing，ZHANG Ai-hua，ZHU Dong，SHAN Chen-xiao，WEN Hong-mei*
（Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，Jiangsu，China）

Abstract：It was the first report on the volatile components contained in Semen Sojae Praepatum.For the analysis，the Semen Sojae Praepatum was analyzed by automatic static headspace and gas Chromatographymass Spectrometry.A total of 27 compounds were identified in Semen Sojae Praepatum through the computer retrieval on the NIST5 mass spectral library.They consisted of 11 generality components， such as 2-Butanone，Butanal 3-methyl-，Butanal 2-methyl-，Limonene and 16 special components， such as copaene，Pyrazine，tetramethyl-， 2，3，5-Trimethyl-6-ethylpyrazine， Bicyclo[2.2.1]heptan-2-ol，1，7，7-trimethyl-，acetate，（1S-endo）-.Meanwhile， the quantitative analysis was taken using area normalization method，which showed that some difference was detected among six batches of Semen Sojae Praepatum.The results indicated that automatic static headspace and gas chromatography-mass spectrometry was a fast，easy，efficient and accurate method to analyze the volatile components in Semen Sojae Praepatum，and we thought that the findings may promote the fingerprint research of the volatile components in Semen Sojae Praepatum，to provide a scientific basis for the establishment of the quality standard.

Key words：Semen Sojae Praepatum；volatile components；automatic static headspace；gas chromatographymass spectrometry

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.023

江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項目“大豆異黃酮雌激素樣作用的代謝組學(xué)研究”（基金編號08KJB360004）；南京中醫(yī)藥大學(xué)青年自然科學(xué)基金項目“淡豆豉活性成分及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究”（基金編號12XZR24）作者簡介：柴川（1987—），女（漢），助理實驗師，碩士研究生，從事藥物及食品分析。

文紅梅（1965—），女（漢），教授，博士生導(dǎo)師，從事藥物分析及代謝研究。

2013-04-01