陳 璐，李素荷，鐘國新，樊永磊，張 璇，黃志毅

(廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州 510405)

慢性萎縮性胃炎(CAG)是指不同病因引起的慢性胃黏膜萎縮性病變。Toll樣受體(TLR)是一種跨膜受體蛋白，通過識別細菌、真菌、細胞壞死成分等內(nèi)源性或外源性配體，參與炎癥反應并促進和提高免疫應答［1］。研究已證實在胃黏膜感染Hp后，TLR4表達增加，從而使核因子－κB(NF－κB)活化，而過強的免疫反應是炎癥發(fā)生的重要機制之一［2］。NF－κB是一類與DNA結(jié)合的二聚體蛋白，為細胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［3］。NF－κB激活后轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，通過與DNA相結(jié)合啟動并調(diào)節(jié)炎癥反應相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。TLR4/NF－κB信號介導了胃部疾病的炎癥反應過程。本實驗旨在探討穴位埋線對TLR4/NF－κB信號傳導通路的影響，從而更好地指導臨床實踐。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

60只SPF級8周齡SD大鼠(由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK粵2008－0002)，雌雄各半，體重180～220 g，采用架式籠養(yǎng)，恒溫(20±1)℃，濕度50% ～60%，光照黑暗各12 h交替，自動通風8～15次/h條件下飼養(yǎng)。采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、自然恢復組、埋線組，每組15只。

1.2 主要試劑及器械

試劑:甲基－硝基－亞硝基胍(MNNG，生產(chǎn)批號:GNGMH日本東京化成工業(yè)株式會社)，兔抗鼠TLR4多克隆抗體 (生產(chǎn)批號:BA0299，美國Abcame)，兔抗鼠NF－κB多克隆抗體(生產(chǎn)批號:BA0614，美國Abcame)，SP試劑盒(生產(chǎn)批號:C0103，武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色試劑盒(生產(chǎn)批號:ARl012，武漢博士德生物工程有限公司)，10%中性緩沖福爾馬林固定液(生產(chǎn)批號11011301，廣州維格斯生物科技有限公司)。器械:①針具:6號一次性注射針頭(浙江京環(huán)醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn))，華佗牌30號1.5寸不銹鋼毫針(蘇州醫(yī)療用品廠);②埋植用羊腸線:0000號鉻制羊腸線(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)。

1.3 模型復制與治療

正常對照組普通飼料正常喂養(yǎng)。除正常對照組外，其余各組于普通飼料喂養(yǎng)1周后，采用自由飲用100 mg/L甲基－硝基－亞硝基胍(MNNG)配合饑飽失常法復制大鼠CAG模型［4－6］。將MNNG用蒸餾水配制成1 g/L濃度的儲存液，4℃冰箱避光冷藏保存，每周配制1次，用時將儲存液配成100 mg/L濃度的飲用液，裝入包裹錫紙的飲水瓶中，每天更換，讓大鼠自由飲用，同時配合饑飽失常，連續(xù)造模12周。于第12周末，各組隨機抽取2只大鼠處死，取胃，行病理檢查，判斷模型成功與否。CAG的病理診斷標準參照文獻制定［7］:固有腺體萎縮;黏膜肌層增厚;可有腸上皮化生或假幽門腺上化生;固有膜炎癥;可有淋巴濾泡形成。

造模成功后將正常對照組、模型組大鼠處死，取材固定;自然恢復組大鼠普通飼料正常喂養(yǎng)，只抓取不治療;埋線組選取大鼠“足三里”、“中脘”、“脾俞”穴埋線治療［8］。操作:定位后使用彎剪、脫毛露先行脫毛，毛脫盡后用生理鹽水擦拭脫毛部位，以減少脫毛露對大鼠皮膚的刺激。準備完畢后，穴位用2.5%的碘酒消毒，75%的酒精脫碘。將0.5 cm長的0000號羊腸線從6號注射針頭的針尖處裝入針體，此時注射針頭內(nèi)作為針芯的30號1.5寸不銹鋼毫針稍退后，線頭與針尖內(nèi)緣齊平，背腰部穴位在局部下方向上平刺、腹部斜刺、下肢穴位直刺，刺至所需深度，邊推針芯，邊退針管，將羊腸線埋植于穴位皮下組織或肌層內(nèi)，線頭不外露，消毒針孔。每周治療1次，共治療8周。

1.4 指標檢測與方法

1.4.1 胃黏膜組織病理學觀察 實驗結(jié)束后，大鼠禁食、禁水24 h，乙醚吸入麻醉，剖腹，距賁門和幽門1.5 cm離斷取出全胃并處死。沿胃大彎側(cè)剖開，冰生理鹽水沖洗后，濾紙吸干鋪開，固定于10%中性甲醛，常規(guī)取材，石蠟包埋，包埋組織進行連續(xù)切片，切片厚4～5 μm，蘇木素－伊紅染色(HE染色)，置光鏡下觀察，并進行顯微攝影。

1.4.2 免疫組化法檢測TLR4和NF－κB表達 實驗結(jié)束后，大鼠胃黏膜組織進行石蠟包埋，包埋組織進行連續(xù)切片，切片厚4～5 μm，附于多聚賴氨酸包被的載玻片備用。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、微波抗原修復后，按試劑盒說明書以SP法進行免疫組織化學染色，DAB顯色，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，檢測TLR4和NF－κB的表達。顯微鏡下，細胞質(zhì)和/或細胞核呈棕黃色或棕褐色著染為陽性細胞。Olympus病理圖像采集系統(tǒng)400倍光鏡下每張切片隨機選取5個視野拍照，使用MIAS醫(yī)學圖像分析管理系統(tǒng)進行光密度分析，并計算平均光密度值(OD值)。

1.4.3 胃黏膜超微結(jié)構(gòu)觀察 實驗結(jié)束后，大鼠取出全胃并處死。沿胃大彎側(cè)剖開，于胃小彎處快速取約0.1 cm ×0.1 cm ×0.5 cm 的組織(包括胃竇及部分胃體)投入30 g/L戊二醛固定，緩沖液洗滌后再經(jīng)10 g/L四氧化鋨4℃后固定1 h，雙蒸水漂洗，逐級丙酮脫水，環(huán)氧丙烷置換，Epon12包埋。聚合過程:37℃，12 h;45℃，24 h;60℃，24 h。聚合完成后，做超薄切片，甲苯胺藍染色，JEM－1200EX透射電鏡下觀察并記錄結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為統(tǒng)計學有意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠胃黏膜組織病理改變

由封三彩圖1可見，A正常對照組:胃黏膜層厚度大，上皮細胞及腺體排列整齊，大小形狀一致，細胞呈單層柱狀，胞質(zhì)透明或空泡狀，腺體豐富與胃小凹分界清晰，固有腺及粘膜無充血、水腫，黏膜肌層無增生;B模型組:胃黏膜層變薄，肌層增寬，胃小凹變淺，腺體變小，排列紊亂，數(shù)量減少，并有囊性擴張，間質(zhì)有纖維組織增生及淋巴細胞浸潤，可見腸上皮化生現(xiàn)象;C自然恢復組:胃黏膜層變薄，固有膜內(nèi)有淋巴細胞、漿細胞浸潤，肌層增寬，胃小凹變淺，腺體排列紊亂，腺體大小不規(guī)則，可見明顯囊性擴張，腺體數(shù)目減少;D埋線組:胃黏膜層無明顯變薄，胃小凹之間的固有膜內(nèi)，可見少量漿細胞、淋巴細胞浸潤，肌層無增寬，腺體排列整齊，腺體大小稍不規(guī)則，數(shù)量未見明顯減少，但部分腺體可見囊性擴張。

2.2 大鼠胃黏膜組織中TLR4和NF－κB的免疫組化表達情況

各組免疫組化染色陽性細胞(棕褐色)見封三彩圖2、3。TLR4和NF－κB均呈現(xiàn)正常對照組低表達，模型組和自然恢復組高表達，埋線組中度表達。

半定量統(tǒng)計目標蛋白表達量(平均光密度)見表1。各組TLR4表達水平，模型組和自然恢復組均明顯高于正常對照組(P＜0.01)，自然恢復組與模型組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，埋線組較模型組表達減少(P＜0.05)，埋線組與自然恢復組比較表達減少(P＜0.05)。各組NF－κB表達水平，模型組和自然恢復組均明顯高于正常對照組(P＜0.01)，自然恢復組與模型組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，埋線組明顯低于模型組(P＜0.01)，埋線組與自然恢復組比較表達減少(P＜0.05)。

表1 各組TLR4、NF－κB表達平均光密度比較(±s)

表1 各組TLR4、NF－κB表達平均光密度比較(±s)

注:與正常對照組比較，aP＜0.01;與模型組比較，bP＞0.05;與模型組比較，cP ＜0.05，dP ＜0.01;eP ＜0.05。

組別 n TLR4/(OD·μm－2) NF－κB/(OD·μm－2)正常對照組13 0.048 ±0.014 0.057 ±0.022模型組 13 0.213 ±0.019a 0.199 ±0.024a自然恢復組 13 0.196 ±0.010ab 0.183 ±0，010ab埋線組 13 0.145 ±0.012ace 0.120 ±0.017ade

2.3 大鼠胃黏膜組織超微結(jié)構(gòu)改變

由封三彩圖4可見，正常對照組:A1:壁細胞在胃底腺的腺頸部及腺體上半部較多，細胞較大，核呈卵圓形，細胞胞質(zhì)內(nèi)可見分泌小管，小管直徑約1～2 μm，表面有許多微絨毛，小管與胃底腺管腔相通，當壁細胞分泌鹽酸時，分泌小管管徑增大，靜止期壁細胞分泌小管往往縮小以至閉塞，但見微管泡增多，此外壁細胞內(nèi)有豐富的線粒體，線粒體呈圓形或長方形。嵴密呈板層狀，胞質(zhì)內(nèi)還可見少量溶酶體等;A2:主細胞又稱酶原細胞，主要分布于胃腺的基底部及體部，細胞核位于基部，胞質(zhì)內(nèi)可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，少量線粒體和許多有界膜的酶原顆粒，酶原顆粒以胞吐的形式分泌蛋白酶至腺腔。模型組:B1:壁細胞可見輕度核固縮，細胞內(nèi)分泌小管擴張，微絨毛突起退變，線粒體數(shù)量減少，而且線粒體的結(jié)構(gòu)有明顯的損傷，其主要表現(xiàn)為線粒體腫脹，膜缺損，嵴斷裂、基質(zhì)變淡等;B2:主細胞核仁萎縮，染色不均勻，核膜擴張迂曲，有深淺不等的凹陷，胞質(zhì)稀疏，散在擴張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，部分成囊狀，酶原顆粒胞膜不清，分泌顆粒減少，甚至消失。自然恢復組:C1:壁細胞水腫、微管泡系統(tǒng)明顯減少，泡內(nèi)可見絮狀物質(zhì)，基質(zhì)出現(xiàn)大量液化現(xiàn)象，線粒體明顯減少，嵴模糊不清、空泡變性或嵴斷裂，可見輕微核固縮;C2:主細胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體明顯減少，酶原顆粒胞膜不清，分泌顆粒減少，甚至消失。埋線組:D1:壁細胞連接完好，核圓而染色尚均勻，線粒體豐富、結(jié)構(gòu)清楚，微絨毛結(jié)構(gòu)正常，胞漿內(nèi)可見粘原顆粒和豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng);D2:主細胞核圓且位于細胞底部，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，酶原顆粒豐富，線粒體板層嵴清晰可見。

3 討論

TLR4/NF－κB通路是各種炎癥反應的重要傳導通路之一［9］。TLR4是廣泛分布于不同細胞表面的受體，通過激活細胞內(nèi)NF－κB信號通路，活化的NF－κB進入細胞核通過與DNA相結(jié)合啟動并調(diào)節(jié)炎癥反應相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，趨化和激活嗜中性粒細胞，活化淋巴細胞，啟動固有和獲得性免疫［10－11］。NF－κB 是炎癥呈持續(xù)放大反應的中心環(huán)節(jié)。目前已證實慢性萎縮性胃炎胃黏膜的IL－1、IL－6、IL－8及TNF－α等細胞因子和化學趨化因子升高相關(guān)，這些細胞因子和化學趨化因子可引起中性粒細胞的聚集和激活，從而可引起活動性炎癥反應［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠慢性萎縮性胃炎模型中TLR4、NF－κB表達均顯著上調(diào)，提示 TLR4/NF－κB通路激活介導了萎縮性胃炎的炎癥過程。經(jīng)埋線治療后大鼠胃黏膜組織TLR4、NF－κB表達較模型組和自然恢復組顯著下調(diào)，提示其胃黏膜保護作用可能與抑制TLR4/NF－κB通路以減輕慢性炎癥損傷有關(guān)，穴位埋線對于胃黏膜慢性炎癥的改善在組織病理學上也得到了印證。另外，超微結(jié)構(gòu)的改變主要體現(xiàn)在壁細胞線粒體和主細胞溶酶體上，穴位埋線能夠明顯改善線粒體、溶酶體的損傷，從而促進胃黏膜血液循環(huán)，促使胃黏膜各種異常的超微結(jié)構(gòu)恢復［13］，從而起到對胃黏膜的保護和修復作用。

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