江雨 周裕林

（廈門市婦幼保健院中心實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361003）

1 背景介紹

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是全球最常見的致死性常染色體隱性遺傳疾病之一，活嬰發(fā)生率為1／5000～1／10 000，人群攜帶率為1／35～1／50［1］。

臨床上根據(jù)SMA發(fā)病年齡和病程的不同，將患者分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅳ型，其中占患者比例約70%的Ⅰ型臨床表型最為嚴(yán)重，常于6個(gè)月內(nèi)起病，多數(shù)于2歲內(nèi)夭折［2］。1995年，SMA相關(guān)基因被定位于5號(hào)染色體長臂1區(qū)（5ql1.2～13.3），并發(fā)現(xiàn)了反向重復(fù)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存基因（survival motor neuron，SMN）［3］。該基因有 2個(gè)序列高度相似的拷貝：靠近端粒的決定性基因SMN1及靠近著絲粒的修飾SMN2（圖1），兩者之間僅存在5個(gè)堿基的差異，而在編碼區(qū)內(nèi)只存在1個(gè)堿基的差異，即第7號(hào)外顯子上的840C＞T。由于SMN所在的染色體區(qū)域存在眾多重復(fù)和假基因簇等易導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的序列，導(dǎo)致SMN基因發(fā)生缺失或轉(zhuǎn)換的頻率較高，相應(yīng)的表現(xiàn)為人群SMN基因拷貝數(shù)組合復(fù)雜多變。

圖1 SMN基因在染色體5q13中的位置圖譜

脊髓性肌萎縮癥危害嚴(yán)重且無有效治療方法，尤其是占多數(shù)比例的Ⅰ型患兒一旦發(fā)病進(jìn)展迅速、存活期短，生育SMA患兒無疑將給患者家庭帶來經(jīng)濟(jì)和精神的沉重負(fù)擔(dān)，因此開展人群攜帶者篩查，對(duì)高危胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷是降低該病發(fā)生率的惟一途徑。2008年，全美醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics，ACMG）建議不分地域種族，對(duì)所有孕齡人群無差別地實(shí)施SMN1攜帶者基因篩查，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)胎兒實(shí)施產(chǎn)前診斷或植入前診斷，從而減少SMA患兒的出生［4］。隨即在2009年，全美婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會(huì)（American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）提議各國或地區(qū)有必要掌握本地區(qū)SMA流行病學(xué)數(shù)據(jù)，并在具備結(jié)果準(zhǔn)確、成本低廉的檢測方法前提下將SMA攜帶者檢查納入孕前優(yōu)生范疇［5］。目前已報(bào)道的SMA攜帶者檢測方法眾多，不同方法的檢出率、可靠性及經(jīng)濟(jì)性等指標(biāo)也不盡相同，本文就SMN基因拷貝數(shù)分析中3種常見的技術(shù)及2種新方法作綜述如下。

2 SMN1基因攜帶者篩查常見技術(shù)

據(jù)統(tǒng)計(jì)約95%的SMA患者表現(xiàn)為SMN1基因第7外顯子位點(diǎn)純合缺失［6］，另外5%患者為SMN1雜合缺失，即屬于含有微小突變的單拷貝SMN1基因。因此臨床上SMA攜帶者檢測的主要目標(biāo)為SMN1基因單拷貝人群的檢出。目前文獻(xiàn)報(bào)道中最常見的SMN基因拷貝數(shù)分析技術(shù)為變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）、多 重 連 接 探 針 擴(kuò) 增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）技術(shù)。不同技術(shù)在SMN1基因單拷貝攜帶者分析中互有優(yōu)缺（表1），現(xiàn)分述如下。

表1 DHPLC、MLPA、實(shí)時(shí)定量PCR在SMN基因拷貝數(shù)變異分析中的比較

DHPLC是一類在單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）研究中常見的分析技術(shù)，具有成本低、檢測快速、通量高的優(yōu)點(diǎn)。其原理是在部分變性的條件下，通過雜合與純合二倍體在柱中保留時(shí)間的差異判斷是否存在DNA突變。在脊髓性肌萎縮癥檢測中，DHPLC分型的原理是通過將擴(kuò)增產(chǎn)物洗脫峰形及峰高（面積）比例與參照樣本比對(duì)，進(jìn)而推測樣本SMN基因的實(shí)際拷貝數(shù)［7，8］。實(shí)踐應(yīng)用中，DHPLC的分辨力常受到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、檢測環(huán)境等諸多因素的影響，存在檢測可靠性和穩(wěn)定性欠佳的問題。因而該技術(shù)在SMA攜帶者中一般僅用于初級(jí)篩查，診斷結(jié)果常需輔以其他方法進(jìn)行驗(yàn)證。

MLPA是2002年由Schouten等［9］開發(fā)的一種基因拷貝數(shù)分析技術(shù)。其基本原理為特異性探針與靶序列DNA進(jìn)行雜交，之后通過連接、PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分離及數(shù)據(jù)收集、軟件計(jì)算等分析靶序列拷貝數(shù)變異。每個(gè)MLPA探針包括2個(gè)寡核苷酸片段，每個(gè)探針都包括一段引物序列和一段特異性序列。在MLPA反應(yīng)中，2個(gè)寡核苷酸片段都與相鄰的靶序列進(jìn)行雜交，之后使用連接酶進(jìn)行連接。此連接反應(yīng)高度特異，只有當(dāng)靶序列與探針特異性序列完全互補(bǔ)時(shí)，連接酶才能將2段探針連接成一條完整的核酸單鏈；只有當(dāng)連接反應(yīng)完成，才能進(jìn)行隨后的PCR擴(kuò)增并收集到相應(yīng)探針的擴(kuò)增信號(hào)，如果檢測的靶序列發(fā)生點(diǎn)突變或缺失，那么相應(yīng)探針的擴(kuò)增峰便會(huì)降低或缺失。因此，根據(jù)擴(kuò)增峰的改變就可判斷靶序列是否存在拷貝數(shù)的異常。目前荷蘭MRC-Holland公司生產(chǎn)的SMA檢測試劑盒（SALSA MLPA KIT P021）是可供臨床實(shí)施脊髓性肌萎縮癥診斷及攜帶者檢測的惟一商品化產(chǎn)品。其包含的探針組合可同時(shí)檢測SMN1及SMN2基因的第7、8外顯子，針對(duì)純合缺失型患者的檢出率可達(dá)100%。在攜帶者檢測中，由于具有可同步擴(kuò)增的穩(wěn)定拷貝數(shù)內(nèi)參基因及校正品質(zhì)控，其檢測準(zhǔn)確性及可靠性較DHPLC更佳，目前MLPA已成為SMA基因診斷的主流技術(shù)［10-12］。

近年來，隨著相關(guān)儀器設(shè)備價(jià)格的迅速降低，實(shí)時(shí)定量PCR幾乎已成為所有醫(yī)療機(jī)構(gòu)的常規(guī)配置。由于具有操作步驟少、成本低、靈敏度高、無需開蓋檢測等諸多優(yōu)勢，實(shí)時(shí)定量PCR已成為當(dāng)前分子診斷領(lǐng)域的 重要技術(shù)［13］。2002 年，F(xiàn)eldkotter M等［14］率先嘗試用定量PCR方法分析SMN基因拷貝數(shù)，發(fā)展至今該平臺(tái)已衍生出多種SMA攜帶者的檢測方法，具體主要包括以下3類（表2）：①SYBR GreenⅠ染料法：Feldkotter M 等［14］將一個(gè)SMN1：SMN2＝2：0的參照樣本梯度稀釋，模擬不同SMN1拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，并通過未知樣本與標(biāo)準(zhǔn)品熒光crossing point（Cp）值的擬合判斷樣本的實(shí)際拷貝數(shù)，報(bào)道靈敏度為96.2%，特異性為100%。Soloviov OO等［15］則通過引入ALB內(nèi)參基因，并依照相對(duì)定量算法2-△△Ct（Livak method）計(jì)算樣本的SMN1基因拷貝數(shù)。相較在此之前采用的放射性或銀離子標(biāo)記的SMN基因分析方法，熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR法的應(yīng)用大幅度地提升了檢測的易操作性，為大規(guī)模攜帶者篩查提供了可能。但是由于SYBR GreenⅠ等熒光染料本身并無序列特異性，無法區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物與引物二聚體及非特異產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光信號(hào)差異。此外，目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率差異是否穩(wěn)定符合2-△△Ct相對(duì)定量算法的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)也有待驗(yàn)證，因而該方法在攜帶者檢測中的可靠性尚值得商榷。②通用引物結(jié)合特異性探針方法［16］：此類方法采用一對(duì)可同時(shí)擴(kuò)增SMN1和SMN2基因第7外顯子C840T位點(diǎn)的通用引物，并通過針對(duì)差異位點(diǎn)設(shè)計(jì)的特異性Taqman 探針區(qū)分SMN1和SMN2。本課題組通過對(duì)采用此類方法的文獻(xiàn)內(nèi)容進(jìn)行重復(fù)，發(fā)現(xiàn)探針區(qū)分SMN基因的特異性存在局限，無SMN1拷貝的患者同樣會(huì)產(chǎn)生一定強(qiáng)度的SMN1探針雜交信號(hào)，從而干擾了攜帶者篩查檢測中的SMN1基因拷貝數(shù)分析。③特異性引物結(jié)合通用探針方法［17］：此法是通過針對(duì)SMN基因第7外顯子C840T位點(diǎn)設(shè)計(jì)競爭性引物，分別擴(kuò)增SMN1及SMN2基因，再通過兩者共用的Taqman 探針檢測熒光信號(hào)。相較由探針區(qū)分SMN1及SMN2基因，競爭性引物區(qū)分避免了SMN2基因的干擾，提高了分析的準(zhǔn)確性。此外，由于體系中加入了內(nèi)參基因、校正品以及外部標(biāo)準(zhǔn)曲線等多層次質(zhì)控，使得檢測的穩(wěn)定性得以保證。課題組通過此類方法完成了對(duì)56例確定攜帶者的檢測（數(shù)據(jù)未發(fā)表），檢出率達(dá)到96.4%（54／56，2個(gè)攜帶者為同一染色體上存在2個(gè)SMN1拷貝）。另一方面，我們看到，雖然平臺(tái)普及程度較高，但相較于DHPLC及MLPA等使用專用技術(shù)平臺(tái)的SMN基因分型方案，實(shí)時(shí)定量PCR由于設(shè)備型號(hào)規(guī)格眾多，不同研究采用的具體技術(shù)差異往往較大，未形成可供臨床指導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)施方案。因此至今未見應(yīng)用此技術(shù)開展大規(guī)模人群攜帶者篩查的報(bào)道。

表2 常見定量PCR檢測SMN基因拷貝數(shù)方法比較

3 SMN1基因攜帶者篩查新技術(shù)

由于現(xiàn)有SMN1基因攜帶者篩查技術(shù)在檢測成本、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性等存在不同程度的缺陷，因此近年來研究界陸續(xù)發(fā)展了一些新的技術(shù)。這其中高分辨溶解曲線分析（high resolution melting analysis，HRMA）和數(shù)字PCR（Digital-PCR）技術(shù)在未來的SMA攜帶者篩查應(yīng)用中最具潛力。

高分辨熔解曲線分析是一類近年來蓬勃發(fā)展的新型定量PCR衍生技術(shù)，因其在SNP研究中具有操作簡便、檢測快速、成本低廉等諸多優(yōu)勢而倍受關(guān)注［18，19］。該技術(shù)的原理是通過實(shí)時(shí)監(jiān)測升溫過程中飽和熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況，SNP位點(diǎn)異源雙鏈由于不完全匹配會(huì)在升溫過程中率先解開，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強(qiáng)度與時(shí)間曲線上就可以判斷是否存在SNP。而且不同SNP位點(diǎn)、雜合子與純合子等都會(huì)影響熔解曲線的峰形，因此HRMA能夠有效區(qū)分不同SNP位點(diǎn)與不同基因型。從檢測原理來看，由于SMN1和SMN2第7外顯子僅存在一個(gè)堿基的差異，因此兩者不同的拷貝數(shù)組合可使產(chǎn)物熔解曲線峰形發(fā)生變化，從而可通過HRMA實(shí)現(xiàn)區(qū)分。2009年，Chen WJ等［20］率先應(yīng)用HRMA結(jié)合非標(biāo)記探針完成了對(duì)患者及正常人的區(qū)分，但未能實(shí)現(xiàn)對(duì)正常人SMN1基因拷貝數(shù)的定量分析。此后，Morikawa S［21］和 Er TK 等［22］分別嘗試了 HRMA方法的可行性，但均未解決SMN1單拷貝分型技術(shù)。2012年，Dobrowolski SF等［23］通過對(duì)擴(kuò)增引物和檢測體系的改進(jìn)，提出HRMA技術(shù)可對(duì)包括患者及個(gè)別類型攜帶者實(shí)現(xiàn)區(qū)分。從現(xiàn)有的報(bào)道來看，HRMA無需特異性探針及外部標(biāo)準(zhǔn)曲線，降低了檢測成本、簡化了操作步驟并易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，在SMA大規(guī)模人群篩查中具備潛力。但與此同時(shí)，由于人群中SMN基因拷貝數(shù)組合多態(tài)性高，已知類型就多達(dá) 19 種（表 3）［23］，因此 HRMA 對(duì)不同SMN拷貝數(shù)比例間細(xì)微差異的分辨能力尚需驗(yàn)證。此外，由于SMN1：SMN2＝1（2）：0與SMN1：SMN2＝1（2）：1（2）攜帶者與正常人具有相同比例的SMN拷貝數(shù)組合，兩者之間的準(zhǔn)確區(qū)分亦是HRMA技術(shù)亟待解決的問題。

表3 人群中SMN 1、SMN 2拷貝數(shù)組合類型及SMN 1／SMN 2拷貝數(shù)比值

數(shù)字PCR最早在上世紀(jì)末是由Vogelstein B等［24］提出來的一種DNA絕對(duì)定量概念，但直到近兩年才有成熟的檢測平臺(tái)面市。其原理是基于單分子PCR方法并結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算方法對(duì)DNA進(jìn)行定量：將大量的稀釋后的DNA溶液分散至微反應(yīng)器或微滴中，使每個(gè)反應(yīng)器（微滴）的DNA模板數(shù)少于或者等于1個(gè)拷貝。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有DNA模板的反應(yīng)器（微滴）可以檢測到熒光信號(hào)，沒有DNA模板的反應(yīng)器（微滴）則檢出不到信號(hào)（圖2）。最后根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)中的柏松分布原理，推算出原始DNA的濃度或是基因拷貝數(shù)。從檢測原理來看，數(shù)字PCR技術(shù)可準(zhǔn)確定量樣本基因的拷貝數(shù)，而無需使用相對(duì)定量方法中的內(nèi)參基因、標(biāo)準(zhǔn)品及校準(zhǔn)品等復(fù)雜質(zhì)控，在進(jìn)一步提升檢測準(zhǔn)確性的同時(shí)簡化了操作流程。Zhong Q等［25］應(yīng)用最新的數(shù)字平臺(tái)PCR對(duì)包括患者、攜帶者及正常人的20例樣本進(jìn)行了準(zhǔn)確的SMN基因分型，取得了預(yù)想中的結(jié)果。從近年來層出不窮的報(bào)道中可以看到數(shù)字PCR技術(shù)方興未艾，各類研究及應(yīng)用必將日趨深入和廣泛，但是由于目前相關(guān)平臺(tái)的可靠性仍處驗(yàn)證初期，同時(shí)也面臨著檢測成本較高及通量較低的問題，因此短時(shí)間內(nèi)難以作為SMA攜帶者大規(guī)模人群篩查技術(shù)投入臨床應(yīng)用。

圖2 數(shù)字PCR技術(shù)原理示意圖

4 國內(nèi)外SMA基因攜帶者檢測臨床應(yīng)用現(xiàn)狀及展望

由于脊髓性肌萎縮癥攜帶者無臨床表現(xiàn)，因此基因檢測是檢出攜帶人群的惟一可行方案。目前一些發(fā)達(dá)國家和地區(qū)在脊髓性肌萎縮癥攜帶者產(chǎn)前優(yōu)生檢查中已積累了豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，并建立起了從遺傳咨詢到產(chǎn)前診斷的完整實(shí)施方案，SMA患兒的出生數(shù)量呈逐年下降趨勢，取得了較好的社會(huì)效益［11，26-28］。從應(yīng)用層面上看，由于具有穩(wěn)定的商品化解決方案，MLPA是目前國外攜帶者檢測的主流技術(shù)。國內(nèi)雖然也可見相關(guān)研究報(bào)道，但長期以來卻難以作為常規(guī)篩查技術(shù)投入應(yīng)用。分析原因其一可能由于MLPA分析所需的毛細(xì)管測序儀價(jià)格昂貴，配套的進(jìn)口試劑耗材價(jià)格高，導(dǎo)致國內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)該檢測平臺(tái)的普及度不高；其次，MLPA操作步驟多、檢測時(shí)間長、對(duì)技術(shù)人員的操作分析能力要求較高，在醫(yī)療資源緊缺的國內(nèi)未受青睞。相對(duì)而言，定量PCR平臺(tái)在國內(nèi)的普及更為廣泛，目前大多數(shù)二級(jí)以上醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)科或?qū)嶒?yàn)室已實(shí)現(xiàn)配置。但是由于型號(hào)規(guī)格不盡相同，缺乏可供借鑒的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)施方案，文獻(xiàn)報(bào)道的方法往往不容易準(zhǔn)確重復(fù)，使得目前有能力應(yīng)用此技術(shù)開展臨床SMA攜帶率檢測的醫(yī)療機(jī)構(gòu)數(shù)量十分有限。技術(shù)實(shí)施上的障礙再加上疾病相關(guān)的宣傳教育滯后，以至于SMA遺傳優(yōu)生檢查項(xiàng)目在國內(nèi)長期處于空白狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致每年有大量的SMA患兒出生，給社會(huì)及患者家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)?；趪楝F(xiàn)狀，筆者認(rèn)為基于定量PCR平臺(tái)的SMA攜帶者檢測技術(shù)更適合于作為篩查技術(shù)在我國普及應(yīng)用，建立并推廣經(jīng)充分驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)施方案是開展SMA優(yōu)生篩查的必要前提。

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