屈亞錦，屈秋錦，李 超，劉月月，石 迎，劉立濤，任慶海，劉思當(dāng)*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安271018；2.山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，山東濟(jì)南250101；3.夏津縣畜牧獸醫(yī)局，山東夏津253200)

H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza viruses,AIV)在世界范圍內(nèi)多種禽類中流行[1]，引起雞呼吸道癥狀及產(chǎn)蛋率下降[2]，當(dāng)與其他病原共感染時(shí)常導(dǎo)致雞群的高死亡率[3]，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國自1994年首次在廣東省分離到H9N2亞型AIV以來，該病毒在我國雞群中廣為流行，嚴(yán)重制約了我國家禽業(yè)的健康發(fā)展。此外，國內(nèi)外有多起人感染H9N2亞型AIV的病例報(bào)道，許多血清學(xué)調(diào)查顯示我國有一定比例的人群已經(jīng)感染過H9N2病毒，血清陽性率高達(dá)13.7%～37.2%[4]。因此，對H9N2亞型AIV的監(jiān)測不僅能夠指導(dǎo)養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展而且具有重要的公共衛(wèi)生意義。

血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)構(gòu)成流感病毒囊膜纖突，是流感病毒所有蛋白中最重要的一個(gè)。HA主要功能包括與宿主唾液酸細(xì)胞受體特異性結(jié)合[5]；在病毒吸附和穿膜過程中起關(guān)鍵作用；HA上裂解位點(diǎn)的序列直接影響AIV的致病性[6]。但HA基因變異頻率很高，抗原位點(diǎn)或潛在糖基化位點(diǎn)氨基酸的突變即可影響到病毒抗原性和致病性，受體結(jié)合區(qū)域氨基酸的變異能夠?qū)е虏《臼荏w結(jié)合性的改變，進(jìn)而影響病毒感染的宿主范圍。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確判斷H9N2亞型AIV的變異趨勢對于有效預(yù)防該病具有重要意義。

本研究對2011年在中國北方地區(qū)家禽中分離到的11株H9N2亞型AIV擴(kuò)增其HA基因，對其受體結(jié)合位點(diǎn)、潛在糖基化位點(diǎn)以及裂解位點(diǎn)進(jìn)行比較分析，并對病毒受體結(jié)合特性進(jìn)行了檢測，為我國禽流感的科學(xué)防控提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株 本實(shí)驗(yàn)中11株AIVA/chicken/Shandong/091/2011(CK/SD/091/11)、A/chicken/Shandong/022/2011(CK/SD/022/11)、A/chicken/Henan/053/2011(CK/HN/053/11)、A/chicken/Liaoning/084/2011(CK/LN/084/11)、A/chicken/Shandong/0175/2011(CK/SD/0175/11)、A/chicken/Shandong/037/2011(CK/SD/037/11)、 A/chicken/Shandong/017/2011(CK/SD/017/11)、 A/chicken/Shandong/048/2011(CK/SD/048/11)、A/chicken/Hebei/099/2011(CK/HB/099/11)、A/chicken/Beijing/0110/2011(CK/BJ/0110/11)、A/chicken/Tianjin/0211/2011(CK/TJ/0211/11)由本實(shí)驗(yàn)室自山東、河南、河北、北京等中國北方地區(qū)的發(fā)病雞或死亡雞中分離，并鑒定為H9N2亞型，病毒接種SPF雞胚，48h后收取雞胚尿囊液，測定血凝效價(jià)，經(jīng)細(xì)菌檢驗(yàn)無污染后作為種毒貯存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 High Pure Viral RNA Kit、RT-PCR Kit購自 Invitrogen公司；PCR M IX、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；α-2,3唾液酸酶購自TaKaRa公司；1%雞紅細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 HA基因測序及分析 依據(jù)GenBank登錄的H9N2HA序列，用軟件Oligo4設(shè)計(jì)PCR引物，設(shè)計(jì)引物序列如下：HA F：GGGGAGCAAAAGCAG GGGAATTTC：HA R：GGTTATTAGTAGAAACAA GGGTGTTTTTGCCAAT，擴(kuò)增長度為1620bp。按RNA提取試劑盒操作說明書，自尿液中提取病毒基因組RNA，用Unit 12：AGCAAAAGCAGG引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按常規(guī)法進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送華大基因公司測序。

測序結(jié)果經(jīng)DNAStar 5.0軟件推導(dǎo)氨基酸序列，對裂解位點(diǎn)、受體結(jié)合位點(diǎn)及潛在糖基化位點(diǎn)分析，并與GenBank中登錄的國內(nèi)外H9N2AIV株的HA基因序列進(jìn)行比較和分析，用MEGA4.1繪制遺傳進(jìn)化樹，用Bootstrap對進(jìn)化樹的可靠性進(jìn)行評價(jià)，重復(fù)1000次，分析遺傳進(jìn)化關(guān)系。

1.4 紅細(xì)胞法測定AIV受體結(jié)合特性 分別用自制的1%雞紅細(xì)胞，1%綿羊紅細(xì)胞和1%唾液酸酶處理過的雞紅細(xì)胞，對待測病毒進(jìn)行HA試驗(yàn)。其中雞紅細(xì)胞具有α-2,3及α-2,6兩種唾液酸受體；綿羊紅細(xì)胞已被證實(shí)只具有α-2,3唾液酸受體[7]；α-2,3唾液酸酶處理過的雞紅細(xì)胞只具有α-2,6唾液酸受體，通過病毒與以上幾種紅細(xì)胞結(jié)合特性的差別來判斷流感病毒的受體結(jié)合特性。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：若病毒結(jié)合雞紅細(xì)胞及綿羊紅細(xì)胞，而不結(jié)合α-2,3唾液酸酶處理過的雞紅細(xì)胞，表明該病毒只具有α-2,3唾液酸受體結(jié)合特異性。

若病毒結(jié)合雞紅細(xì)胞(α-2,3唾液酸酶處理過的和未處理過的)，而不結(jié)合綿羊紅細(xì)胞，表明該病毒只具有α-2,6唾液酸受體特異性。

若病毒既結(jié)合雞紅細(xì)胞(α-2,3唾液酸酶處理過的和未處理過的)，又結(jié)合綿羊紅細(xì)胞，那么該病毒既具有α-2,3唾液酸受體結(jié)合特性，也具有α-2,6唾液酸受體結(jié)合特性。

2 結(jié) 果

2.1 HA基因RT-PCR擴(kuò)增 11株H9N2AIV提取的RNA經(jīng)Unit 12反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板，以HA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，均得到了大小約為1600bp的擴(kuò)增片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

M：DNA Marker 5000；1：空白對照；2～12：檢測樣本M:DL5000Marker;1:Negative control;2-12:RT-PCR products from AIV isolates

2.2 HA基因進(jìn)化分析 從世界范圍內(nèi)分離的H9N2亞型AIV，其HA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示4個(gè)主要分支，分別為BJ/94-like、G1-like、Koreanlike以及Ty/66-like。我國流行的H9N2病毒主要分布在BJ/94like分支，偶爾在珍禽和人中分離到屬于G1-like分支的病毒，此次在我國北方家禽中分離到的11株家禽源H9N2病毒均屬于BJ/94-like分支，但其中一株病毒與其他10株病毒處于不同的進(jìn)化分支(圖 2)。

2.3 HA基因關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析 流感病毒的血凝素蛋白切割位點(diǎn)的氨基酸序列特征是鑒定流感病毒致病力的一個(gè)重要指標(biāo)。1999年之前我國流行的H9N2亞型AIV裂解位點(diǎn)均為PSRSSR/GLF模式，分析顯示11株H9N2病毒裂解位點(diǎn)的P5位均出現(xiàn)了A336S變異，變?yōu)镻-S-R-S-S-R模式，但仍保持非連續(xù)堿性氨基酸，符合低致病力AIV的序列特征(表 1)。

11株病毒中，除了CK/TJ/0211/11、CK/HB/099/11，其余9株病毒均具有8個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，值得注意的是所有病毒HA均出現(xiàn)了P295S變異，導(dǎo)致新增加了一個(gè)新的潛在糖基化位點(diǎn)，并且該位點(diǎn)靠近裂解位點(diǎn)，該位點(diǎn)是否能夠影響病毒的裂解活性或者改變病毒的抗原性尚值得深入研究(表1)。

對11株病毒的受體結(jié)合位點(diǎn)氨基酸分析表明，相比于我國早期的H9N2亞型AIV，近期的病毒均由Q226L變異，之前曾有研究報(bào)道Q226L變異能夠改變病毒的受體結(jié)合性，本次分離的病毒是否也出現(xiàn)受體結(jié)合性的改變將在隨后的受體結(jié)合性試驗(yàn)中加以驗(yàn)證。

圖111 株H9N2流感病毒的HA基因進(jìn)化樹Fig.1Phylogenetic trees of the HA genes of eleven H9N2influenza viruses isolated from Northern China

2.4 紅細(xì)胞法測定病毒受體結(jié)合特性 利用只含有α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受體的紅細(xì)胞分別與病毒結(jié)合，測定病毒的受體結(jié)合特性。如表2所示，所檢測的11株H9N2病毒與含有α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受體的紅細(xì)胞均能結(jié)合，表明我國北方流行的家禽源H9N2病毒同時(shí)具備α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受體結(jié)合特性。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)分離的11株病毒中10株處于BJ/94-like分支，1株處于不同的進(jìn)化分支，表明我國北方家禽源H9N2病毒進(jìn)化方向呈多元化。本實(shí)驗(yàn)表明11株H9N2病毒裂解位點(diǎn)均變?yōu)镻-S-R-S-S-R模式，仍符合低致病力AIV的特征，但這種裂解模式的改變是否能夠影響病毒的毒力尚值得深入研究。HA基因的潛在糖基化位點(diǎn)也是影響毒力的重要因素之一[8]。糖基化位點(diǎn)的增加或減少對病毒的抗原性以及其他生物學(xué)活性均具有一定的影響。潛在的糖基化位點(diǎn)可以通過兩種方式影響AIV的毒力：一是受體結(jié)合位點(diǎn)的糖基化會(huì)影響AIV和宿主細(xì)胞的結(jié)合水平并且會(huì)使其毒力明顯增加[9-10]。另有學(xué)者認(rèn)為HA上的的糖基化位點(diǎn)不僅能夠增強(qiáng)AIV的毒力，而且還與提高AIV在雞上的適應(yīng)性密切相關(guān)[11]。另一方面裂解位點(diǎn)附近的糖基化位點(diǎn)還可能影響到蛋白酶對HA基因前體蛋白的裂解，裂解位點(diǎn)一旦發(fā)生糖基化作用，該病毒的毒力就可能增強(qiáng)[12]。本實(shí)驗(yàn)所有病毒株均出現(xiàn)了P295S變異，并且該位點(diǎn)靠近裂解位點(diǎn)，這很可能會(huì)影響病毒的抗原性和裂解活性。

表1 H9N2亞型禽流感病毒HA基因關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)比對Table 1Comparison of am ino acid sequences of HA gene of representative chicken H9N2viruses

表2 紅細(xì)胞法檢測病毒受體結(jié)合類型Table 2Receptor binding specificity of the different viruses as determ ined by amodified CRBC HA assay

一般認(rèn)為HA蛋白受體部位上第216位氨基酸若為亮氨酸(L)，則其識別SAα2,6Gal；若為谷氨酰胺(Q)，則識別SAα2,3Gal；若為蛋氨酸(M)，則同時(shí)識別兩種受體。本研究表明我國北方流行的家禽源H9N2AIV同時(shí)具備α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受體結(jié)合特性，這種受體結(jié)合特性的改變增加了AIV感染哺乳動(dòng)物的可能性，進(jìn)而為產(chǎn)生禽源、哺乳動(dòng)物源的新型提供了可能。

目前國內(nèi)對H9N2亞型的防控主要采用滅活苗免疫策略，但在宿主長期高免疫選擇壓力下，病毒基因會(huì)通過發(fā)生頻繁突變以逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)控，這是當(dāng)前免疫失敗的主要原因。因此，有必要對我國的H9N2AIV進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測，以了解我國流行的H9N2病毒的變異情況，為指導(dǎo)禽流感疫情防控以及篩選疫苗病毒株提供依據(jù)。

[1]Wu Z Q,Ji J,Zuo K J,et al.Cloning and phylogenetic analysis of hemagglutinin gene of H9N2subtype avian influenza virus from different isolates in China during 2002to 2009[J].Poult Sci，2010,89(6):1136-1143.

[2]Nagarajan S,Rajukumar K,Tosh C,et al.Isolation and pathotyping of H9N2avian influenza viruses in Indian poultry[J].Vet M icrobial,2009,133(1-2):154-163.

[3]Biswas P K,Christensen JP,Ahmed S S,et al.Avian influenza outbreaks in chickens[J].Bangladesh Emerge Infect Dis,2008,14(12):1909-1912.

[4]陳妍梅，葛萬運(yùn)，黃川，等.廣西健康青年H9、H6亞型禽流感病毒血清抗體調(diào)查[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8(6)：985-986.

[5]Rogers G N,Paulson JC,Daniels R S,et al.Single amino acid substitutions in influenza hemagglutinin change receptor binding specificity[J].Nature,1983,304(5921):76-78.

[6]Munster V J,Schrauwen E J,de W it E,et al.Insertion of a multi basic cleavage motif into the hemagglutinin of a low-pathogenic avian influenza H6N1virus induces a highly pathogenic phenotype[J].Viral,2010,84(16):7953-7960.

[7]Ito T,Suzuki Y,Takada A,et al.Differences in sialic acidgalactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection[J].Viral，1997,71:3357.

[8]Irina A,Rudneva,Natalia A,et al.Restoration of virulence of escape mutants of H5and H9influenza viruses by their readaptation to m ice[J].JGene Virol，2005,86:2831-2838.

[9]Perdue M L,Latimer J,Greene C,et al.Consistent occurrence of hemagglutinin variants among avian influenza virus isolates of the H7subtype[J].Virus Research,1994,34(1):15-29.

[10]Lee M S,Chang P C,Shen JH,et al.Genetic and pathogenic characterization of H6N1avian influenza viruses isolated in Taiwan between 1972and 2005[J].Avi Dis,2006,50(4):561-571.

[11]LIU Hong-qi,Huang Yong,Cheng Jian,et al.Genetic mutations of the hemagglutinin gene of H9N2subtype avian influenza viruses under the selective pressure of vaccination[J].Chi J Virol,2002,18(2):149-154.

[12]Owen R E,Yamada E,Thompson C I,et al.Alterations in receptor binding properties of recent human influenza H3N2viruses are associated w ith reduced natural killer cell lyses of infected cells[J].JVirol,2007,81(20):11170-11178.