劉建東，孫留克，林躍智，那 雷，王雪峰，杜 承，周建華*，曲娟娟

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/大動(dòng)物病研究室，黑龍江哈爾濱 150001）

14匹馬經(jīng)典MHC-Ⅰ類分子多態(tài)性分析

劉建東1,2，孫留克2，林躍智2，那 雷2，王雪峰2，杜 承2，周建華2*，曲娟娟1*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/大動(dòng)物病研究室，黑龍江哈爾濱 150001）

為分析馬經(jīng)典MHC-I類分子的多態(tài)性，本研究從馬外周血單個(gè)核細(xì)胞提取總RNA，并采用RT-PCR方法對(duì)14匹馬經(jīng)典MHC-I類分子(包括編碼肽結(jié)合區(qū)的大部分區(qū)域、α3區(qū)、穿膜區(qū)以及胞漿區(qū)）進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析。結(jié)果顯示，14匹實(shí)驗(yàn)馬各自具有2個(gè)～4個(gè)MHC-I等位基因，其在不同馬匹之間的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的差異性，主要分布在2個(gè)分支。盡管如此，各馬匹間均表達(dá)具有1個(gè)或1個(gè)以上相同或高度同源的對(duì)應(yīng)經(jīng)典MHC-I類分子的mRNA。該研究結(jié)果為正在開展的針對(duì)馬傳染性貧血病毒減毒疫苗核心蛋白(p26）以及其他免疫原的CTL表位的篩選提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

馬；主要組織相容性復(fù)合物；多態(tài)性；RT-PCR

主要組織相容性復(fù)合體I類分子(Major histocompatibility complex，MHC-I）是具有高度多態(tài)性的糖蛋白[1]。其編碼的分子能夠與經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞加工處理后的抗原肽結(jié)合，成為激活相應(yīng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的始動(dòng)信號(hào)之一[2-3]。其功能是決定機(jī)體對(duì)微生物感染和移植排斥等的特異性免疫應(yīng)答特性的重要因素之一[4]。經(jīng)典的MHC-I類分子的多態(tài)性不僅表現(xiàn)在預(yù)期等位基因的數(shù)量，還表現(xiàn)在附加表達(dá)不同單倍型的I類基因[5]?；蚪M發(fā)生的高頻度堿基替換是形成MHC-I類分子高度多態(tài)性的原因，也是機(jī)體對(duì)疾病正向選擇的結(jié)果[5]。馬的MHC-I基因包括啟動(dòng)子區(qū)、信號(hào)肽區(qū)、α1、α2、α3區(qū)、跨膜區(qū)、胞漿區(qū)及3'非編碼區(qū)。其中α1和α2區(qū)編碼MHC分子肽結(jié)合區(qū)具有較高的多態(tài)性[6]。由于不同個(gè)體 MHC-I的 α1、α2、α3區(qū)呈高度多態(tài)性，對(duì)同一病原的抗原多肽親和性不同，而導(dǎo)致免疫應(yīng)答，特別是T細(xì)胞免疫應(yīng)答的差異[7]。本研究參照文獻(xiàn)[6]方法，利用RT-PCR技術(shù)對(duì)該區(qū)的主要序列進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)馬的經(jīng)典MHC-I類分子的多態(tài)性進(jìn)行了量化分析，為馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV）的CTL表位研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 14匹實(shí)驗(yàn)用馬均來自黑龍江省通遼，遺傳背景不明。

1.2 引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道的馬經(jīng)典MHC-I類分子擴(kuò)增用特異性引物，上游引物PA：5'-GCAGGAGGGGCCGGAGTATT-3'下游引物：PB：5'-CCGTCTCACACTTTCTG-3'。引物由博仕生物技術(shù)有限公司合成，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為858 bp。

1.3 目的基因的RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序 采用TRIzol試劑(Axygen）按產(chǎn)品說明提取馬全血總RNA。以總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃30 s、72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(Omega Bio-Tek公司）回收后克隆至pMD18-T載體中。利用OMEGA小量質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒后，由北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，通過DNAMAN和DNAStar進(jìn)行序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 RT-PCR擴(kuò)增馬MHC-I類分子 從實(shí)驗(yàn)用馬分離的PBMC提取的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)特異性引物PA和PB擴(kuò)增后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示擴(kuò)增片段約為850 bp，與預(yù)期目的片段的長(zhǎng)度相符。

2.2 序列測(cè)定及分析 對(duì)每匹馬擴(kuò)增的基因隨機(jī)挑選10個(gè)～20個(gè)克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定。根據(jù)特定插入序列的有無，馬MHC-I類分子可分為經(jīng)典和非經(jīng)典兩類。將所獲得的序列通過生物學(xué)軟件進(jìn)行分析后顯示，在所擴(kuò)增序列中未見非經(jīng)典的MHC-I類分子[8]。由于MHC-I類分子具有共顯性特征，本研究首先刪除了相互間核苷酸序列小于1%的克隆，并推測(cè)其可能的等位基因數(shù)(表1）。隨后，根據(jù)所選取的78條序列進(jìn)行了多態(tài)性的比較分析。分析結(jié)果顯示，本研究中所用的14匹馬，分別具有2個(gè)～4個(gè)等位基因。進(jìn)化樹分析數(shù)據(jù)顯示(圖1），14匹馬匹所獲得的序列分屬于2個(gè)大的分支。鑒于不同的MHC-I類基因?qū)乖奶岢誓芰Φ牟町?，以及等位基因的同源情況。我們推測(cè)這7匹馬可能具有相近的抗原肽提呈能力。本研究結(jié)果不但可以為正在開展的針對(duì)EIAV減毒疫苗核心蛋白(p26）的CTL表位的篩選提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)，以確定EIAV弱毒疫苗免疫保護(hù)建立過程中有效的CTL表位，也是研究其他馬傳染性疾病，特別是病毒性傳染性疾病T細(xì)胞免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)之一。

表1 不同實(shí)驗(yàn)馬匹等位基因表達(dá)情況Table 1 Expression of MHC-I alleles in PBMCs isolated from 14 the horses in the experiment

圖1 14匹馬共78個(gè)MHC-I分子克隆的核苷酸序列進(jìn)化樹分析Fig.1 Alignment of nucleotide sequences predicted by all the 78 MHC-1 cDNA clones from 14 horses examined in this study

[1]Bjorkman,P J,Saper M A,Samraoui B,et al.Structure of the human class I histocompatibility antigen,HLA-A2[J].Nature,1987,329(6139）:506-512.

[2]Granados D P,Yahyaoui W,Laumont C M,et al.MHC I-associated peptides preferentially derive from transcripts bearing miRNA response elements[J].Blood,2012,119(26）:181-191.

[3]Zhang Y,Williams D B.Assembly of MHC class I molecules within the endoplasmic reticulum[J]Immunol Res,2006,35(1-2）:151-162.

[4]Huang A Y,Golumbek P,Ahmadzadeh M,et al.Role of bone marrow-derived cells in presenting MHC class I-restricted tumor antigens[J].Science,1994,264(5161）:961-965.

[5]Tallmadge R L,Campbell J A,Miller D C,et al.Analysis of MHC class I genes across horse MHC haplotypes[J].Immunogenetics,2010,62(3）:159-172.

[6]Chung C,Leib S R,Fraser D G,et al.Novel classical MHC class I alleles identified in horses by sequencing clones of reverse transcription-PCR products[J].Eur J Immunogenet,2003,30(6）:387-396.

[7]Cadavid L F,Shufflebotham C,Ruiz F J,et al.Evolutionary instability of the major histocompatibility complex class I loci in New World primates[J].PNAS USA,1997,94(26）:14536-14541.

[8]Holmes E C,Ellis S A.Evolutionary history of MHC class I genes in the mammalian order Perissodactyla[J].J Mol Evol,1999,49(3）:316-324.

Analysis the polymorphism of classical MHC class I alleles expressed by peripheral blood mononuclear cells from 14 horses in Heilongjiang Province

LIU Jian-dong1,2,SUN Liu-ke2,LIN Yue-zhi2,NA Lei2,WANG Xue-feng2,DU Cheng2,ZHOU Jian-hua2*,QU Juan-juan1*

(1.College of Life Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China）

In this study,cDNA sequences encoding majority region of the classical MHC class I from 14 domestic horses were amplified by RT-PCR from total RNA extracted from PBMC.The amplified fragments include coding regions for the peptide binding region(α1, α2 and α3）,the transmembrane region and the cytoplasmic domain.Results revealed that there were 2-4 MHC-I alleles in each of these 14 horses,which were consistent with the data published by other studies.In addition,the expressed MHC-I molecules of different horses were noticeable different,showing as two major branches in the phylogenetic tree.However,at least one identical or highly homology MHC-I molecule was identified among these each of these horses.These results provided essential information for the study of CTL epitope in EIAV and other immunogens.

horse;MHC;polymorphism;RT-PCR

S852.4

A

1008-0589(2013）10-0852-03

10.3969/j.issn.1008-0589.2013.10.19

*Correspondingauthor

2013-04-10

國(guó)家十二五科技重大專項(xiàng)(2012ZX10001008-004）；國(guó)家自然科學(xué)基金(31070809）；國(guó)家自然科學(xué)青年基金(30901349）

劉建東(1986-），男，山西長(zhǎng)治人，碩士研究生，主要從事慢病毒研究.

*通信作者：E-mail：jianhua_uc@126.com

(本文編輯：李 爽）