李云霞，劉曉麗，張 玥,2，韓宗璽，邵昱昊，劉勝旺,2，孔憲剛*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/禽傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150030)

鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)屬于黃病毒科黃病毒屬蚊媒病毒類恩塔亞病毒群的坦布蘇病毒[1-3]。DTMUV為單股正鏈RNA，有囊膜，病毒粒子50nm，不具有凝集雞、鴨、鵝、鴿等動物紅細胞的特性[4]。DTMUV病發(fā)病率高，可達100%，死亡率約25%～15%，甚至高達50%以上[5]。病鴨臨床主要表現(xiàn)為共濟失調(diào)甚至雙腿癱瘓等[6]。剖檢病變?yōu)槁殉渤溲?、出血，卵泡破裂、退化和變形，肝臟、脾臟腫大出血[7]。DTMUV病危害嚴重，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。

本研究將Du/CH/LSD/110128株在鴨胚纖維細胞(DEF)中連續(xù)傳12代，得到一株穩(wěn)定的細胞適應(yīng)毒，在此基礎(chǔ)之上進行該細胞適應(yīng)毒編碼區(qū)基因序列的測定及序列比對，分析DTMUV在DEF中的適應(yīng)性以及適應(yīng)細胞后的變異情況。

1 材料和方法

1.1 病毒株及實驗動物 Du/CH/LSD/110128由本實驗室分離鑒定；10日齡SPF鴨胚由本研究所實驗動物中心提供。

1.2 主要實驗材料及試劑 E.coli感受態(tài)細胞TG1及DEF由本研究室制備；pMD18-T、PrimeScriptROne Step RT-PCR Kit試劑盒和總RNA提取試劑RNAiso Plus均購自TaKaRa公司；Gel Extraction Kit購自O(shè)mega公司。

1.3 病毒在DEF中的適應(yīng) 將Du/CH/LSD/110128株鴨胚尿囊液，接種于新制備的DEF單層細胞中，于37℃5%CO2條件感作1h，加入細胞維持液于37℃ 5%CO2培養(yǎng)7d，每天觀察CPE，連續(xù)傳至12代，取每代病毒液，以常規(guī)方法檢測其TCID50，并按Reed-Muench方法計算TCID50[1]。

1.4 病毒RNA提取 參照文獻[8]方法，F(xiàn)10代病毒液反復(fù)凍融3次后，提取RNA，于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 全基因組擴增 參照已發(fā)表序列GenBank(KC136210)引物，RT-PCR擴增編碼區(qū)基因，PCR產(chǎn)物回收、克隆至pMD18-T載體中，重組質(zhì)粒由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.6 序列分析 測得序列剪輯、拼接完成后，將F10序列與參考序列進行序列比對分析，分析其遺傳變異性。參考病毒株分別是分離于中國的DTMUV(JQ920420、JX273153、JF459991、JF270480、KC136210)、雞源DTMUV(JQ627862)、鴿源DTMUV(JQ920425)、鵝源DTMUV(JQ920424)以及黃病毒屬巴格扎病毒(BAGV)(NC_012534)、恩他耶病毒(NTYV)(NC_018705)、西尼羅病毒(WNV)(NC_009942)、日本腦炎病毒(JEV)(NC_001437)、登革熱病毒(DENV1)(NC_001477)、 DENV2(NC_001474)、DENV3(NC_001475)、 DENV4(NC_002640)、 黃 熱病毒(YFV)(NC_002031)。

2 結(jié) 果

2.1 病毒在細胞中的適應(yīng) 將Du/CH/LSD/110128在DEF中連續(xù)傳代培養(yǎng)，F(xiàn)2代病毒為101.6TCID50/0.1m L，F(xiàn)6代病毒為101.7TCID50/0.1m L，自F8代起，DTMUV在DEF中的病毒滴度達到一個穩(wěn)定的水平，并且F10代病毒滴度為104.4TCID50/0.1m L左右(圖1)。細胞接種F10病毒后72h出現(xiàn)明顯病變，主要表現(xiàn)為細胞皺縮、變圓最終死亡脫落(圖2)。

圖1 DTMUV在DEF中TCID50的變化曲線Fig.1The TCID50 changing curve of DTMUV passed in DEF

圖2 細胞病變Fig.2Cytopathic effect infected w ith DTMUV in DEF

2.2 編碼區(qū)基因擴增 病毒感染DEF后F10代細胞裂解液提取的RNA為模板，用10對引物進行一步法RT-PCR，分別擴增得到10個片段(圖3)。

2.3 序列分析

2.3.1核苷酸序列分析將測得的10個片段進行序列剪輯、拼接，參照文獻[9]對各個基因進行劃分，本實驗病毒株各個基因在基因組順序為5'-UTRC-Pr/M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'-UTR，其中C、PrM和E蛋白為結(jié)構(gòu)蛋白，其余為非結(jié)構(gòu)蛋白。有學者稱國際上對黃病毒屬成員的分類標準為NS5基因3'端長約1kb的區(qū)域中同種病毒的核苷酸序列同源性大于84%[5]。本研究利用DNAStar軟件包中的MegA lign軟件的Clustal W Method進行F10代病毒的NS5基因與參考病毒株NS5基因的多序列比對，結(jié)果顯示F10代病毒與DTMUV同源性為98.4%～98.7%，但與鴿源DTMUV同源性較低，為87.8%，與Nataya病毒和Bagaza病毒同源性分別為74.2%和75.3%，而與其他黃病毒屬病毒同源性在65.7%以下(圖4)。

圖3 編碼區(qū)基因擴增Fig.3Amplification of encoding gene by RT-PCR

圖4 NS5基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4Phylogenetic tree based on nucleic acid sequence of NS5gene

2.3.2推導氨基酸序列差異分析將Du/CH/LSD/110128細胞毒F10(KC800808)與親本病毒F0(KC136210)、 BYD1(JQ920420)、 雞 源 CK-SD-11(JQ627862)和鴿源DTMUV(JQ920425)進行推導氨基酸序列比較，顯示F10與F0存在10個推導氨基酸差異位點，其中3個差異位點存在于NS1蛋白、2個存在NS3蛋白，Pr蛋白、M蛋白、E蛋白、NS2A蛋白和NS5蛋白各存在1個差異位點，F(xiàn)10與BYD1存在14個差異位點，主要在E蛋白和NS3蛋白，與CK-SD-11存在21個差異點，主要在E和NS5蛋白，與鴿源DTMUV存在16個差異位點，主要在E和NS5蛋白(表1)。

表1 F10與參考病毒株氨基酸突變位點的比較Table 1Comparison of amino acid mutations in F10w ith reference strain

3 討 論

DTMUV在DEF中的病毒滴度隨著傳代次數(shù)的增加而升高，并在F8代達到穩(wěn)定水平，并且F10代病毒NS5基因序列分析結(jié)果顯示F10代病毒與DTMUV親本病毒以及DTMUV其他參考病毒株無較大的差異，這些結(jié)果表明DTMUV已經(jīng)適應(yīng)DEF。

本實驗測得DTMUV F10編碼區(qū)基因長10278nt，編碼一個大的多聚蛋白，由3425個氨基酸組成，這個大的多聚蛋白由3個結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C、前膜蛋白加工后的M蛋白和囊膜蛋白E)、7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、和NS5)。黃病毒屬NS1蛋白可能參與了病毒RNA的復(fù)制過程并與病變形成有關(guān)[10]，NS3蛋白參與蛋白質(zhì)水解加工與病毒復(fù)制，與病毒致病性密切相關(guān)[11]，NS5蛋白參與病毒基因組復(fù)制并在調(diào)控宿主抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。

F10的推導氨基酸序列與參考病毒株F0、BYD1、CK-SD-11和鴿源DTMUV的推導氨基酸序列進行比對，分析比對結(jié)果顯示F10代病毒與F0代病毒的10個氨基酸差異位點中5個位點的氨基酸發(fā)生了極性的改變：I147T、 W956C、A1086S、T2045I、S3416P，147位為Pr蛋白，956位和1086位在NS1蛋白，2045位在NS3蛋白，3416位在NS5蛋白，氨基酸的改變可能會導致蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)甚至功能的改變，參考黃病毒屬非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS3、和NS5的功能[10-12]，這些變化一方面將為研究病毒在細胞的適應(yīng)及增殖性能提供一定的分子學基礎(chǔ)，另一方面可能也預(yù)示著Pr基因、NS1基因、NS3基因和NS5基因所編碼的蛋白在病毒適應(yīng)細胞的過程中發(fā)揮著一定的作用。

另外分析推導氨基酸的比對結(jié)果表明F10代病毒存在5個特殊的推導氨基酸位點：I147T，V285A，R679Q，R1926K，T2045I，F(xiàn)10為細胞適應(yīng)毒，而其他4株病毒均為分離的野毒，這些氨基酸突變可能是病毒在適應(yīng)細胞過程中發(fā)生的一些關(guān)鍵的變化。

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