姚 琴， 王美入， 楊家榮， 胡小平

（旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室／西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院，楊凌 712100）

由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）引起的棉花黃萎病是一種土傳植物維管束萎蔫病害，在世界范圍內(nèi)危害嚴(yán)重。自20世紀(jì)90年代以來，棉花黃萎病在我國呈現(xiàn)危害加重的趨勢并造成了巨大的經(jīng)濟損失，目前已成為制約我國棉花（Gossypiumspp.）高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的主要瓶頸［1－2］。

大麗輪枝菌的微菌核（microsclerotia，MS）能長期存在于棉花殘體和土壤中，成為翌年侵染棉花的初侵染源，直接影響病害的發(fā)生和發(fā)展［3］。由于初侵染源存活時間長［4］、病原菌致病力多變以及棉花品種抗病性差等多種因素，棉花黃萎病的防治難度很大。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中多采用化學(xué)農(nóng)藥防治此病害，但因防治效果較差，且存在農(nóng)藥殘留、抗藥性和環(huán)境污染等問題，該類病害的防治急需尋找新的出路。利用植物根系分泌物的抑菌活性而采用的間作或輪作模式，是以植物為藥源取代化學(xué)殺菌劑，簡單易行、高效低廉的植物保護措施，成為防治病害的有效手段。近年來，植物根系分泌物在植物病害防治中的研究和應(yīng)用日漸受到人們的關(guān)注。大量研究表明，某些植物根系分泌物對土傳病害的病原菌具有明顯的抑制作用，云南黑籽南瓜根系分泌物能抑制黃瓜枯萎病菌的生長［5］，蕎麥的根系分泌物對小麥全蝕病菌有明顯抑制作用［6］，不同抗性的黃瓜品種根系分泌物能抑制枯萎病病原菌的生長［7］，不同抗性西瓜品種的根系分泌物對西瓜枯萎病菌有一定的抑制作用［8］。

關(guān)于寄主植物根系分泌物對大麗輪枝菌影響的研究已有報道。袁虹霞［9］、吳玉香等［10］研究發(fā)現(xiàn)抗病棉花品種的根系分泌物能抑制黃萎病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)，劉娜等［11］研究認(rèn)為嫁接茄子根系分泌物能夠抑制黃萎病菌生長。非寄主植物根系分泌物對棉花黃萎病菌的影響尚未見報道。韭菜（Allium tuberosum Rottl.ex Spreng）［12］、大 蔥 （Allium fistulosumLinn.）［13］、薰衣草薄荷（Mentha piperita ‘Lavandula’）［14］、廣 藿 香 ［Pogostemon cablin（Blanco）Benth.］［15］和薰衣草（Lavandulaspp.）［16］具有一定抑菌作用，且已有研究表明韭菜和大蔥等蔥屬作物是瓜類蔬菜很好的輪作前茬［17］，韭菜與香蕉輪作可以較大程度地減輕香蕉枯萎病的發(fā)生［18］。薄荷、藿香和薰衣草為芳香植物，其地上部分具有一定的抑菌作用，但其根系分泌物是否也具有抑菌效果尚無報道。為此，本試驗利用水培法收集根系分泌物，探究其對大麗輪枝菌菌絲生長、孢子和微菌核萌發(fā)的影響，以期篩選出適宜與棉花間作或輪作的作物，為棉花黃萎病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物韭菜、大蔥、野薄荷、薰衣草和藿香均購自西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝場。棉花黃萎病病原菌（Verticillium dahliae Kleb.）XJ2008菌株分離自新疆棉花植株，由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院土傳病害實驗室提供。

1.2 植物根系分泌物對大麗輪枝菌的抑制作用

1.2.1 植物根系分泌物的收集

收集采用自制水培系統(tǒng)，由塑料瓶、泡沫圓板和自動加氧泵構(gòu)成。挖取在無病苗圃中培養(yǎng)2個月的健康均一植物幼苗，盡量不傷根，以蒸餾水洗根后移栽到水培系統(tǒng)中，用泡沫圓板固定。每瓶10株，共5瓶，向瓶中加入適量霍格蘭營養(yǎng)液使根系沒入其中，通氣培養(yǎng)。每7d更換一次營養(yǎng)液，共4次，每次更換的營養(yǎng)液保存于4℃下備用。收集結(jié)束后稱取植物根系鮮重，以確定母液濃度。將收集到的根系分泌液過濾除去雜質(zhì)后，通過內(nèi)裝約500mL XAD－4吸附樹脂的玻璃層析柱，控制流速為1～1.5L／h。再用3倍體積的甲醇洗脫，所得洗脫液在35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，溶于5mL甲醇中，隨后將其配成濃度為1.2g／mL（1g／mL為1mL水溶液中含有1g鮮根的根系分泌物）的母液并保存于4℃冰箱備用。

1.2.2 植物根系分泌物對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制作用

采用菌絲生長速率法［19］，配制不同濃度的植物根系分泌物稀釋液，將4mL不同濃度提取液加入到16mL已融化并冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基中，充分搖勻并迅速倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，使根系分泌物最終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6g／mL。以純PDA培養(yǎng)基平板作為空白對照，每個處理重復(fù)3次。在平板中央接入直徑為5mm的菌餅，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待對照菌落生長至培養(yǎng)皿邊緣（約20d）時，采用十字交叉法測定菌落直徑，比較不同濃度根系分泌物對大麗輪枝菌菌絲生長抑制程度，并計算抑制率。

1.2.3 植物根系分泌物對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的抑制作用

在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中放入滅菌載玻片，分別吸取20μL新鮮的大麗輪枝菌菌液和不同濃度的植物根系分泌物稀釋液滴于載玻片中央，配制成濃度為0.1、0.2、0.4、0.6g／mL的混合液。培養(yǎng)皿置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，分別于8、16、24h后在20倍物鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，計算抑制率。每個處理重復(fù)3次，試驗重復(fù)3次。

1.3 盆栽試驗測定植物根系分泌物對大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)的影響

1.3.1 大麗輪枝菌微菌核的產(chǎn)生與收集

微菌核的產(chǎn)生與收集方法參考白應(yīng)文等［20］的方法。將收集到的微菌核在干燥器中干燥過夜。微菌核與適量滑石粉充分混合后放于15mL滅菌的離心管中，4℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 植物殘體對大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)的影響

按照比例為1∶2混勻基質(zhì)和田園土，所得土壤呈弱堿性（pH 7.2），有機質(zhì)1.21%、全氮1.096%，有效氮52.6%、速效磷10.4μg／g、速效鉀272.0μg／g、穩(wěn)滲濾0.72mm／s。此后將土壤在121℃下濕熱滅菌120min。挖取在無病苗圃中培養(yǎng)3個月的健康均一植株種植于花盆中，每盆10株，每種植物5盆，在陰涼環(huán)境中緩苗5d。

將獲得的微菌核／滑石粉混合物再次混勻后，加入無菌蒸餾水配成懸浮液，超聲震蕩1min。鏡檢計數(shù)后配制成2000MS／mL的懸浮液。充分混勻后，取1mL注入無菌尼龍袋（2cm×3cm，孔徑75μm）中。

植物經(jīng)緩苗長勢良好后，挖出盆中部分土壤。將裝有微菌核的尼龍袋埋入植物根系聚集處，覆上無菌土后以無菌水澆灌使土壤含水量保持在25%左右。每盆埋入3袋微菌核，重復(fù)3次，對照為在無菌混合土壤中埋入微菌核。

分別在3、6、9周后取出尼龍袋，經(jīng)浸泡洗去土壤和雜質(zhì)后剪成小塊，置于裝有無菌水的離心管中，超聲振蕩1min。鏡檢計數(shù)，將微菌核濃度調(diào)節(jié)為100～200MS／mL，吸取0.5mL懸浮液涂布于果膠酸瓊脂培養(yǎng)基［21］上，22～23℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，試驗重復(fù)3次。15d后，觀察微菌核萌發(fā)情況并計算萌發(fā)率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0for Windows統(tǒng)計軟件包和 Microsoft Office Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物根系分泌物對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制作用

5種植物根系分泌物對大麗輪枝菌菌絲生長均有抑制作用，但存在差異：韭菜對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制效果最好，其抑制率達(dá)到22.74%～87.92%，在濃度為0.2～0.6g／mL時，其抑制率均高于其余四者，在濃度為0.4g／mL，其抑制率顯著高于其余四者；野薄荷次之，抑制率為24.49%～85.30%，在濃度為0.2g／mL和0.6g／mL時，與韭菜的抑制作用無顯著差異，且高于其余3種植物；藿香的抑制效果最差，為17.86%～70.02%。隨著濃度的升高，植物根系分泌物對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制作用逐漸增強，其中韭菜的抑制率增長迅速，在濃度為0.4g／mL時，其抑制率從46.26%增加到77.86%，其余4種增長較為緩慢。在濃度達(dá)到0.6g／mL時，抑制率增長速度放緩，處理之間的差異也逐漸減小。

圖1 植物根系分泌物對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of root exudates on mycelium growth of V.dahliae

通過對菌落形態(tài)的觀察（圖2），隨著濃度增加，菌落直徑明顯減小且邊緣呈現(xiàn)不規(guī)則，氣生菌絲的生長受到明顯抑制，在濃度為0.6g／mL時，菌落未能擴展。在濃度為0.4g／mL和0.6g／mL時，菌落中不同程度地出現(xiàn)了大麗輪枝菌的休眠結(jié)構(gòu)微菌核。

圖2 大麗輪枝菌在含不同濃度韭菜根系分泌物PDA平板上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of V.dahliae on PDA with root exudates of Chinese chives at different concentrations

2.2 植物根系分泌物對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的抑制作用

5種植物根系分泌物均能抑制大麗輪枝菌孢子的萌發(fā)（表1）。隨著濃度的升高，抑制作用逐漸增強，但增強的幅度有所不同：韭菜和藿香抑制率上升幅度較大，分別為22.66%～100.00%和6.57%～75.10%；大蔥的上升幅度較小，為10.86%～56.57%。在同一濃度下，隨著時間延長，根系分泌物對孢子萌發(fā)的抑制作用呈減弱趨勢。大麗輪枝菌孢子對韭菜根系分泌物最為敏感，在濃度為0.1g／mL時抑制率已達(dá)22.66%，明顯高于其他植物。韭菜根系分泌物在5種植物中抑制作用最強，在相同濃度相同處理時間，韭菜根系分泌物的抑制率均高于其他植物根系分泌物。總體來看，韭菜根系分泌物對大麗輪枝菌孢子的抑制作用最強，其次是野薄荷，薰衣草最弱。

表1 植物根系分泌物對大麗輪枝菌孢子萌發(fā)的抑制作用1）Table 1 Inhibitory effects of the root exudates on spore germination of V.dahliae

2.3 根系分泌物對大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)的影響

盆栽試驗中，5種植物根系分泌物均能明顯抑制大麗輪枝菌微菌核的萌發(fā)（表2）。隨著處理時間的延長抑制作用增強，從第3周到第6周抑制率大幅度上升，其中大蔥的抑制率從32.30%上升到62.94%，上升了30.64%，幅度最大；韭菜上升了17.05%，幅度最小；第6周到第9周上升趨勢逐漸趨緩。韭菜對微菌核的抑制作用最強，在第3周和第6周抑制率分別為63.15%、80.20%，顯著高于其他4種植物，在第9周時抑制率為87.58%，與野薄荷無明顯差異，但顯著高于其他3種植物。微菌核對韭菜根系分泌物最敏感，第3周時抑制率就已達(dá)到63.15%，顯著高于其他植物。野薄荷對微菌核也有較好的抑制效果，在第3周、第6周和第9周時，其抑制率分別達(dá)到了49.03%、58.12%和78.13%；大蔥的抑制作用稍弱，抑制率為32.30%～66.03%；抑制作用最弱的是藿香和薰衣草，其抑制率分別為25.21%～51.56%和29.60%～53.25%，兩者無明顯差異。

表2 植物根系分泌物對大麗輪枝菌微菌核萌發(fā)的抑制率1）Table 2 Inhibition of the germination of V.dahliae microsclerotia by root exudates

3 討論

本試驗中，5種植物根系分泌物對大麗輪枝菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)均有抑制作用。隨著濃度的升高，根系分泌物的抑制作用逐漸增強，這與大蒜［22］、分蘗洋蔥［23］根系分泌物對枯萎病病原菌影響的研究結(jié)果一致。5種植物中，韭菜根系分泌物對大麗輪枝菌的抑制效果最好，其抑制率、敏感度都明顯優(yōu)于其他植物。野薄荷根系分泌物表現(xiàn)出良好的抑菌作用，僅次于韭菜。大蔥也具有一定的抑菌效果。徐寧［24］等研究認(rèn)為大蔥根系分泌物對黃瓜枯萎病菌有很好的抑制作用，可見大蔥根系分泌物可能存在一定的廣譜性。薰衣草和藿香的根系分泌物抑菌作用較弱，這可能與其根系不發(fā)達(dá)有關(guān)。植物根系分泌物抑菌程度不同，可能與植物種類、品種、發(fā)育時期以及根系分泌物的收集方法等的差異有關(guān)［25］，這些差異導(dǎo)致了所得根系分泌物的成分和濃度的不同。

微菌核作為大麗輪枝菌的休眠結(jié)構(gòu)，其存活和消長與土壤溫度、pH和有機質(zhì)等多種因素有關(guān)［26］。López－Escudero［27］等證實熏衣草和百里香的植物殘體能有效降低大麗輪枝菌微菌核的存活力。Heal［28］等的研究表明，微菌核與根系分泌物也有密切關(guān)系，當(dāng)微菌核受到寄主根系分泌物的刺激后可萌發(fā)侵入根系，隨即產(chǎn)生菌絲并定殖于木質(zhì)部，最終導(dǎo)致維管束堵塞而引起植株局部或整體萎蔫。本試驗研究結(jié)果顯示非寄主植物的根系分泌物能不同程度地抑制微菌核萌發(fā)，其中韭菜和野薄荷的抑制作用最強，藿香最弱。抑制程度的不同可能與植物根系分泌物中能打破微菌核休眠的活性成分的組成和濃度有關(guān)。隨著時間的延長，抑制作用增強且增加幅度由大到小，這可能是由于植物根系在定植后才能大量產(chǎn)生具有殺菌活性的次生物質(zhì)的原因。非寄主植物根系分泌物抑制微菌核萌發(fā)的機理還有待進(jìn)一步研究。

前人研究表明，植物根分泌物對土壤病原菌的抑制作用與根分泌物中具有抑菌作用的物質(zhì)有直接關(guān)系。周寶利等［29］研究發(fā)現(xiàn)，嫁接茄子在受到黃萎菌脅迫時能分泌大量具有明顯抑菌作用的丁二酸二甲酯；李勇等［30］證實人參根系分泌物成分苯甲酸、鄰苯二甲酸二異丁酯等與人參部分致病菌的菌落生長和孢子萌發(fā)呈負(fù)相關(guān)；耿廣東［31］等研究表明，辣椒根系分泌物中的鄰二酸二甲酯具有抑菌作用。根系分泌物的抑菌活性與土壤中的生物和非生物因子有著密切關(guān)系，活性的高低在一定程度上還取決于土壤整個微生物群落的相互作用［32］。本研究中篩選出具有較好抑菌作用的韭菜和薄荷，其根系分泌物中的有效抑菌成分還需進(jìn)一步研究，另外本試驗僅限于室內(nèi)，有待于在大田環(huán)境的土壤、土壤微生物及生態(tài)環(huán)境中進(jìn)一步驗證。

Jing［33］報道韭菜與番茄間作，韭菜根系分泌物抑制了由青枯菌（Pseudomonas solanacearum）侵染引起的番茄青枯病。Gómez－Rodríguez等［34］報道，在番茄和萬壽菊間作系統(tǒng)中，萬壽菊的根分泌物可以有效抑制番茄旱疫病病原菌（Alternaria solani）孢子的萌發(fā)，大大減輕番茄枯萎病的發(fā)生。本研究結(jié)果也證明植物根系分泌物能夠抑制大麗輪枝菌菌絲、孢子和微菌核的活力。由此可見，利用非寄主植物與棉花間作或輪作防控黃萎病具有潛在的應(yīng)用前景。

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