孫偉 蘇建榮 許淑珍

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨檢中心，北京 100050)

阿薩希毛孢子菌 (Trichosporon asahii)為一種條件致病酵母樣真菌，是毛孢子菌病最常見(jiàn)的致病菌，可引起免疫功能低下患者的各種機(jī)會(huì)性感染［1-2］，因此，對(duì)其毒力因子的研究已倍受關(guān)注。本研究對(duì)其臨床尿路感染分離株的溶血活性及生物膜形成能力進(jìn)行測(cè)定，并分析其與基因分型的關(guān)系，探討尿路感染阿薩希毛孢子菌的基因特點(diǎn)及毒力強(qiáng)弱，為臨床流行病學(xué)研究和阿薩希毛孢子菌感染的診治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

阿薩希毛孢子菌，共10株，分離自8名尿路感染患者(7名男性，1名女性，均為2008～2012年期間我院ICU患者，住院期間均有尿路插管史)，并經(jīng)過(guò)VITEK2 COMPACT初步鑒定。

患者編號(hào)與菌株編號(hào)一致，其中選取3株分離自患者5的菌株納入研究(菌株間隔2個(gè)月，編號(hào)為5-1，5-2，5-3)。

1.2 主要試劑

2，3-二 (2-甲氨基-4-硝基-5-磺苯基)-5［(苯胺基)羧基］-2氫-氫氧化四氮唑 (XTT)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、嗎啡啉丙磺酸(MOPS)均購(gòu)自Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基 (Gibco公司);酵母粉、蛋白胨、沙堡弱培養(yǎng)基、血平板 (Oxfoid公司);無(wú)菌培養(yǎng)皿及 96孔板 (Costar);酶標(biāo)儀 (TECAN，Infinite200);VITEK2 COMPACT(法國(guó)生物梅里埃公司)。

1.3 基因型別的鑒定

取新鮮培養(yǎng)的阿薩希毛孢子菌菌落，無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液，離心收集菌體。玻璃珠振蕩法［3］提取 DNA，利用 IGS1區(qū)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增(26SF:5 ＇-ATCCTTTGCAGACGCTTGA-3 ＇;5SR:5 ＇-AGCTTGACTTCGCAGATCGG-3＇)，PCR 產(chǎn)物送北京Invitrogen公司雙向測(cè)序，所得序列在Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索，并與已知的12種阿薩希毛孢子菌基因型別進(jìn)行比較［4］，得到10株臨床分離株的具體基因型別。本研究中當(dāng)同源性超過(guò)95%時(shí)視為相同基因型。

1.4 溶血活性測(cè)定

溶血試驗(yàn)參照平板法進(jìn)行，并進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整［5］。將新鮮培養(yǎng)的阿薩希毛孢子菌菌落用無(wú)菌生理鹽水制備成濃度為108CFU/mL的菌懸液，取5 μL菌懸液和5 μL生理鹽水分別點(diǎn)種于含糖的羊血平板(7 mL新鮮羊血加到100 mL含3%葡萄糖的沙堡葡萄糖培養(yǎng)基中，pH值為5.6±0.2)，35℃、5%CO2培養(yǎng)。96 h后透射光下觀(guān)察菌落周?chē)陌胪该魅苎h(huán)，可觀(guān)察到與菌落同圓心的溶血環(huán)，測(cè)定菌落直徑 (mm)與總直徑 (菌落+溶血環(huán))并計(jì)算溶血指數(shù) (記做Hz)，Hz=總直徑/菌落直徑，可反應(yīng)溶血活性的強(qiáng)弱［6-7］。Hz=1無(wú)溶血活性，Hz＞1有溶血活性，且比值越大，溶血活性越強(qiáng)。白念珠菌ATCC90028和ATCC2201分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次。

1.5 生物膜形成能力的測(cè)定

采用XTT還原比色法進(jìn)行定量分析［8］。測(cè)定依據(jù)為代謝活性細(xì)胞可使黃色的四唑鹽XTT裂解成橘黃色甲駑染料。收集沙堡弱培養(yǎng)基上新鮮培養(yǎng)的阿薩希毛孢子菌，無(wú)菌PBS溶液洗滌2次后，重懸于 pH7.0(0.165M MOPS調(diào)節(jié) pH)的 RPMI1640培養(yǎng)基中，菌懸液終濃度為105CFU/mL。取2 mL菌懸液加入直徑35 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿(Costar)，35℃培養(yǎng)。60 min后無(wú)菌PBS洗滌培養(yǎng)皿兩次，去除未貼壁的菌體，加入2 mL新鮮的 RPMI1640-MOPS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每隔24 h更換一次培養(yǎng)基。未加入菌體的PBS溶液孔作為陰性對(duì)照，其余操作完全相同。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)上清，2 mL無(wú)菌 PBS洗滌兩次。1.5 mL XTTPMS溶液 (XTT終濃度12.5 μmol/L)分別加入洗滌好的生物膜孔和空白對(duì)照孔，35℃避光反應(yīng)2 h。反應(yīng)上清離心后分裝入96孔微量滴定板，于492 nm(參比波長(zhǎng)630 nm)處讀取吸光度值。試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以(±s)表示，兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間的比較采用ANOVA檢驗(yàn)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義以P＜0.05和P＜0.01表示。

2 結(jié) 果

2.1 阿薩希毛孢子菌的基因分型

所分離10株阿薩希毛孢子菌經(jīng)IGS1區(qū)特異性引物26sF/5sR擴(kuò)增后與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的12種基因型別進(jìn)行比對(duì)，分別屬于基因型Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型，其中以基因型Ⅳ型為主 (7/10=70%)，其余分別為Ⅲ型 (2/10=20%)和Ⅰ型 (1/10=10%)。

2.2 體外溶血活性

10株阿薩希毛孢子菌的溶血活性均為陽(yáng)性，活性值介于1.08～1.44之間，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 生物膜形成能力

為建立阿薩希毛孢子菌在聚苯乙烯表面形成生物膜的最佳環(huán)境，在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇105CFU/mL接種濃度、菌體貼壁60 min、培養(yǎng)72 h作為最佳試驗(yàn)條件，此條件下，生物膜形成活性與XTT試驗(yàn)結(jié)果具有最好的相關(guān)性。試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次。10株臨床分離株的生物膜形成能力在492 nm處吸光度值介于0.06～0.93之間，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 阿薩希毛孢子菌溶血活性及生物膜形成能力與其基因型的關(guān)系

表1尿路感染阿薩希毛孢子菌的溶血活性(±s，n=3)Tab.1 Hemolytic activity of urinary tract infection pathogenic Trichosporon asahii

表1尿路感染阿薩希毛孢子菌的溶血活性(±s，n=3)Tab.1 Hemolytic activity of urinary tract infection pathogenic Trichosporon asahii

注:Hz為溶血指數(shù);各分離株溶血活性與陰性對(duì)照相比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01

陰性對(duì)照基因型編號(hào) 1 2 3 4 5-1 5-2 5-3 6 7 8 1.22 ±0.26 1.01 ±0.02ⅣⅣⅣⅣⅠⅢⅣHz 1.16 ±0.14 1.08 ±0.23 1.43* ±0.14 1.20 ±0.28 1.22 ±0.24 1.33* ±0.21 1.20 ±0.23 1.15 ±0.24 1.44# ±0.29ⅣⅣⅢ

表2尿路感染阿薩希毛孢子菌的生物膜形成能力結(jié)果(±s，n=3)Tab.2 Biofilm formation ability of urinary tract infection pathogenic Trichosporon asahii

表2尿路感染阿薩希毛孢子菌的生物膜形成能力結(jié)果(±s，n=3)Tab.2 Biofilm formation ability of urinary tract infection pathogenic Trichosporon asahii

注:各菌株生物膜形成能力與陰性對(duì)照采用單因素方差分析相比較，#P＜0.01

陰性對(duì)照基因型編號(hào) 1 2 3 4 5-1 5-2 5-3 6 7 8ⅣⅣⅢⅣⅣⅣⅣⅠⅢⅣ0.08 ±0.01 A492/630 0.51# ±0.04 0.78# ±0.07 0.91# ±0.11 0.59# ±0.07 0.06 ±0.01 0.06 ±0.01 0.09 ±0.02 0.25# ±0.11 0.93# ±0.13 0.76# ±0.09

10株尿路感染阿薩希毛孢子菌基因型分別屬于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型，其中以Ⅳ型為主。通過(guò)將基因型與溶血活性或生物膜活性對(duì)應(yīng)，發(fā)現(xiàn)10株臨床分離株均具有溶血活性，其中以Ⅲ型溶血活性最高。除患者5的3個(gè)分離株外，其他均具有生物膜形成能力，5-1、5-2、5-3分離株均屬于基因型Ⅳ，且各株溶血活性與生物膜形成能力相近，故推測(cè)為同一菌株的反復(fù)感染。

3討 論

毛孢子菌病是一種慢性、頑固、難治的系統(tǒng)性真菌病，呈世界性分布，且其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，而阿薩希毛孢子菌是引起該病的主要致病菌，具有種內(nèi)基因多態(tài)性的特點(diǎn)。本研究采用IGS1區(qū)的多態(tài)性特點(diǎn)來(lái)確定阿薩希毛孢子菌［9］的具體基因型別。IGS1區(qū)序列分析已成為重要的流行病學(xué)研究工具，許多研究以IGS1區(qū)序列特點(diǎn)對(duì)阿薩希毛孢子菌的基因分布特點(diǎn)進(jìn)行了探討［3，10-11］。目前，已知的阿薩希毛孢子菌基因型別共有 12種［12］，本研究結(jié)果以基因型Ⅳ型為主(70%)，其次為基因型Ⅲ和基因型Ⅰ。這與美國(guó)、日本、南美、歐洲等以 I型為主不同［3，9-10，13］，說(shuō)明在我國(guó)阿薩希毛孢子菌的基因型分布具有顯著的地域特異性。國(guó)內(nèi)其他學(xué)者的相關(guān)研究顯示［4］，我國(guó)阿薩希毛孢子菌主要為基因型I和Ⅳ，并未分離出基因型Ⅲ型的菌株。本研究結(jié)果與之既有相同又有區(qū)別，這可能與研究對(duì)象的標(biāo)本來(lái)源不同有關(guān)。本研究標(biāo)本來(lái)源為單一尿標(biāo)本，而其他研究標(biāo)本來(lái)源復(fù)雜，包括血液、痰、皮膚等。

溶血性是病原微生物破壞亞鐵血紅素后提取鐵元素的能力，這種能力在感染過(guò)程中很重要。目前已知溶血性是念珠菌的毒力因素，但對(duì)于不同念珠菌或非白念珠菌的溶血性的研究卻很少。本研究從溶血現(xiàn)象出發(fā)，半定量分析了臨床分離的10株阿薩希毛孢子菌的溶血活性。結(jié)果顯示，所分離菌株均具有溶血活性，其中以基因型Ⅲ型菌株的溶血活性最強(qiáng)。

生物膜是一種黏附于非生物或生物表面的微生物菌落，包裹在自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)中，是微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中為了適應(yīng)生存環(huán)境而形成的存在形式。多數(shù)生物膜感染與近年來(lái)各種醫(yī)用材料(各種支架、導(dǎo)管、瓣膜、起搏器、人工關(guān)節(jié)等材料)的使用率增高密切相關(guān)，因此介入性器械可以作為阿薩希毛孢子菌生物膜構(gòu)建的黏附基質(zhì)，使微生物群體黏附于細(xì)胞外多聚材料表面造成持續(xù)播散性感染，并且導(dǎo)致感染灶的耐藥性增加而不易清除［8］。研究表明，微生物的致病力與其在聚合材料表面形成生物膜的能力呈正相關(guān)［14］。本研究采用各種導(dǎo)管常用的材料聚苯乙烯為黏附基質(zhì)，觀(guān)察尿路感染阿薩希毛孢子菌在其表面形成生物膜的能力，并用XTT比色還原法測(cè)定各菌株的生物膜形成活性大小，結(jié)果顯示基因型Ⅲ型菌株的生物膜形成能力最強(qiáng)，這可能與該分離株患者的慢性感染有關(guān)(具體臨床資料未展示)。

患者5的三次取材菌株的生物膜形成能力及溶血活性與其他菌株相比均無(wú)明顯增加，卻造成患者臨床的持續(xù)感染，可能與該腦?；颊叱Ｄ瓴骞苡嘘P(guān)。也可能該患者的分離株除生物膜和溶血活性之外的其他致病因子如磷脂酶、酸性蛋白酶等活性較強(qiáng)，有待進(jìn)一步深入研究。

本研究結(jié)果存在研究病例數(shù)相對(duì)偏少的局限性，但是，研究中所有菌株均分離自尿路感染患者，研究結(jié)果有助于了解阿薩希毛孢子菌造成深部感染甚至播散性感染的流行病學(xué)特點(diǎn)，尤其對(duì)阿薩希毛孢子菌尿路感染的診斷和治療具有一定的臨床意義。

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