梁濤 劉珂鳳 何宏 趙桂秋 王婷 喻文倩

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，青島 266003;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，青島 266003)

真菌性角膜炎是一種世界范圍的角膜感染性疾病，致盲率極高，治療一直較為棘手。在目前臨床上常用的眼部抗真菌藥物在不同程度上具有抗菌譜窄、穿透力差、毒副作用較大等缺點(diǎn)，治療效果并不十分理想。因此，確定真菌的毒力因子、發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)已經(jīng)成為抗真菌基礎(chǔ)研究和研制新型抗真菌藥物的首要環(huán)節(jié)。以往此類研究常用的方法是基因敲除，然而由于茄病鐮刀菌等絲狀真菌中同源重組的效率極低，基因敲除的效果并不理想［1］。RNA干擾是一種通過(guò)雙鏈小分子RNA(dsRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，利用RNA干擾誘導(dǎo)的RNA沉默已經(jīng)成功用于癌癥、病毒感染的治療，其效果遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的基因或抗體的阻斷性治療。我們通過(guò)制備RNA干擾載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化茄病鐮刀菌孢子并對(duì)ALP沉默菌株ALP轉(zhuǎn)錄水平及酶活性進(jìn)行檢測(cè)，以期獲取ALP基因沉默菌株，為將來(lái)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究真菌侵襲機(jī)制提供有利條件。

1 材料與方法

1.1 菌株及主要培養(yǎng)基

標(biāo)準(zhǔn)茄病鐮孢菌株 (Fusarium solani)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院真菌中心提供，編號(hào):CMCC(F)B24c;JM109為本實(shí)驗(yàn)室保存;真菌沙氏(Sabouraud)培養(yǎng)基、2%麥芽糖肉湯液體培養(yǎng)基、YED、LB液體培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;蛋白瓊脂廓清率特殊培養(yǎng)基 (包括瓊脂1.5 g、葡萄糖 2.7 g、氯霉素 0.01 g、無(wú)菌去離子水 100 mL 加入甘氨酸 13 mmol/L、KH2PO429.4 mmol/L、MgSO410 mmol/L、維生素 B13 μmol/L、pH4.5 偶氮白蛋白 0.1 g。)

1.2 方法

雙鏈RNA干擾 (RNAi)的載體質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)Pubmed Genebank中檢索到的茄病鐮刀菌ALP(序列號(hào)S71812)的保守區(qū)域RNA干擾部位，設(shè)計(jì)ALP功能域的長(zhǎng)度分別為498 bp、531 bp兩個(gè)序列作為干擾片段。設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的兩套引物，通過(guò)一系列PCR擴(kuò)增和雙酶切將其正反向序列插入載體質(zhì)粒pBC-hygro(由法國(guó)Institut de Génétique et Microbiologie Philippe Silar教授惠贈(zèng))中，中間隔以250 bp的GFP序列形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了載體質(zhì)粒pALP1和pALP2(見(jiàn)表1～2)。

表1 擴(kuò)增引物1Tab.1 Amplification primers 1

表2 擴(kuò)增引物2Tab.2 Amplification primers 2

載體質(zhì)粒pALP1和pALP2構(gòu)建的PCR擴(kuò)增體系 以提取的茄病鐮刀菌和GFP基因作為模板，分別以引物X-1至X-6、X-7至X-12依次進(jìn)行一系列PCR擴(kuò)增，部分PCR反應(yīng)體系如下。

Ⅰ用引物X-1和X-2，以茄病鐮刀菌基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段命名為X-A。PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表3。

表3 PCR反應(yīng)體系Tab.3 PCR reaction system

反應(yīng)條件為:第一步，94℃ 7 min;第二步，94℃1 min，58℃ 45 s，72℃ 50 s，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán);第三步，72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、割膠回收，備用。

Ⅱ用X-3和X-4為引物，以GFP基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段命名為X-B。PCR反應(yīng)體系同上，反應(yīng)條件為:第一步，94℃ 7 min;第二步，94℃ 1 min，57℃ 30 s，72℃ 45 s，共進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán);第三步，72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、割膠回收，備用。

1.3 測(cè)序

將所構(gòu)建質(zhì)粒載體pALP1、pALP2送北京博邁德科技發(fā)展公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 構(gòu)建的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化茄病鐮刀菌及抗性篩選

分別將攜帶有pALP1、pALP2的JM109大腸桿菌接種至含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。提取單克隆陽(yáng)性質(zhì)粒，備轉(zhuǎn)化茄病鐮刀菌孢子用。將生長(zhǎng)于Sabouraud培養(yǎng)基中的茄病鐮刀菌1.0×107spores/mL接種于YED液體培養(yǎng)基中。采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法對(duì)茄病鐮刀菌孢子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，參 照 Mukherjee 方 法 略 加 改 進(jìn)［2］，配 制PEG4000-LiAc培養(yǎng)液。將分生孢子懸液與pALP1和pALP2混勻后經(jīng)過(guò)一系列處理后加600 μL 0.1M(pH6.0)的醋酸鋰;涂布于含有潮霉素B(終濃度為200 μg/mL)選擇性培養(yǎng)基平板上28℃培養(yǎng)。挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落涂布于潮霉素B(終濃度為200 μg/mL)抗性的 Sabouraud培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，36 h后觀察結(jié)果。所獲菌株命名為 ΔALP1、ΔALP2。

1.5茄病鐮刀菌ALP基因沉默后轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)

提取鐮刀菌總RNA［3］，RT-PCR檢測(cè)茄病鐮刀菌ALP mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，設(shè)計(jì)合成引物見(jiàn)表4。

表4 設(shè)計(jì)合成引物Tab.4 The designed primers

進(jìn)行一步法 RT-PCR，反應(yīng)條件為:42℃，50 min;95℃，5 min;94℃，30 s;58℃，45 s;72℃，45 s;32個(gè)循環(huán);72℃，7 min，重復(fù)3次。以茄病鐮刀菌18s rRNA為內(nèi)參照，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳后于UNIUER SAL HooD-S.N.75s凝膠成像分析系統(tǒng)分析，分別對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度掃描，得到各條帶的峰面積積分值，計(jì)算它們與18s rRNA比值獲得校正值。

1.6 RNA干擾后茄病鐮刀菌ALP酶活性檢測(cè)

參照文獻(xiàn)［4］制作含有0.1%偶氮白蛋白的蛋白瓊脂廓清特殊培養(yǎng)基，按等邊三角形選取3個(gè)點(diǎn)，各滴加 10 μL標(biāo)準(zhǔn)茄病鐮刀菌、ΔALP1和ΔALP2孢子懸液，每菌株接種6個(gè)平皿，30℃培養(yǎng)12 d。含有偶氮白蛋白，培養(yǎng)基略呈橙黃色。茄病鐮刀菌分泌的ALP可水解培養(yǎng)基底物中的偶氮白蛋白，菌落周圍培養(yǎng)基中的偶氮白蛋白在被水解后逐漸形成透明的暈環(huán)(廓清環(huán))，因此可以通過(guò)測(cè)量廓清環(huán)的大小檢測(cè)茄病鐮刀菌ALP的活性。CH值的計(jì)算參照Price法［5］:CH=菌落半徑/(菌落半徑+廓清環(huán)半徑)。CH值越小，表明真菌蛋白酶分泌量越多、活性越強(qiáng);CH值越大表明蛋白酶分泌量越小、活性越弱，真菌毒力越低。于接種后第12 d測(cè)量各菌株CH值，取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用(±s)表示。采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組間差異用單因素方差分析 (one-way ANOVA)和q檢驗(yàn)。取P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)意義，P＜0.01為差別有顯著統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RNA干擾載體質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建載體質(zhì)粒pALP1和pALP2，提取陽(yáng)性質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，各插入序列測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列一致。

2.2 基因沉默茄病鐮刀菌轉(zhuǎn)錄水平 ΔALP2、ΔALP2 mRNA的檢測(cè)

以標(biāo)準(zhǔn)茄病鐮刀菌為對(duì)照，RT-PCR對(duì)ΔALP1、ΔALP2菌株ALP mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)。半定量分析顯示，ΔALP1菌株ALP mRNA轉(zhuǎn)錄水平為標(biāo)準(zhǔn)菌株的 42.77%(1.248/2.918)，ΔALP2菌株ALP mRNA轉(zhuǎn)錄水平僅為標(biāo)準(zhǔn)菌株的69.57%(2.030/2.918)，兩者較標(biāo)準(zhǔn)菌株差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=184.67，q=10.379～26.943，P＜0.01)，結(jié)果詳見(jiàn)表5。

表5ΔALP1、ΔALP2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化(x珋±s)Tab.5 The changes of ΔALP1 and ΔALP2 gene transcription(珋x ± s)

2.3 RNA干擾后茄病鐮刀菌ALP酶活性檢測(cè)結(jié)果

接種于含有偶氮白蛋白的特殊培養(yǎng)基上的標(biāo)準(zhǔn)茄病鐮孢菌、ΔALP1和ΔALP2菌株30℃培養(yǎng)12 d后，菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明廓清環(huán)，各株菌落直徑大致相同，ΔALP2株的廓清環(huán)明顯小于標(biāo)準(zhǔn)菌株與ΔALP1株，其CH值與后兩者比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q=5.276、5.463，P＜0.01)，結(jié)果詳見(jiàn)表6。

表6ΔALP1、ΔALP2菌株ALP酶活性的變化(x珋±s)Tab.6Changes of△ALP1 and△ALP2 enzymatic activities(x珋±s)

3 討 論

真菌性角膜炎病情嚴(yán)重，鐮刀菌和曲霉菌是我國(guó)主要的眼部致病真菌，其中大部分地區(qū)以鐮刀菌為主。研究顯示該菌引起的角膜炎預(yù)后更差，易導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損害［6-7］。因此，對(duì)鐮刀菌性角膜炎發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究具有很重要的意義。RNA干擾是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守、由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高度特異性降解的現(xiàn)象。通過(guò)該技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，目前被廣泛用于探索基因功能和疾病的基因治療領(lǐng)域。近年來(lái)，隨著大量絲狀真菌基因序列信息的測(cè)定，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究已陸續(xù)展開(kāi)。

對(duì)真菌侵襲力的相關(guān)研究表明，真菌分泌的酶類在其感染宿主的過(guò)程中扮演著重要角色。ALP是從煙曲霉菌培養(yǎng)液中分離出的一種堿性蛋白酶，可以劈開(kāi)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)前肽鏈、使其活性中心暴露，從而使MMP-1、MMP-9等活化，目前被認(rèn)為是致病性真菌潛在的毒力因子。對(duì)煙曲霉菌肺損傷的研究顯示［8］，ALP能夠快速降解人肺組織中I型、III型膠原和纖維連接蛋白，導(dǎo)致呼吸道明顯破壞，并可在1 h內(nèi)完全降解組織切片中的層黏連蛋白。另有研究顯示［9］，茄病鐮刀菌在富有膠原的培養(yǎng)基中能夠產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。但是在它們感染的角膜炎動(dòng)物模型的角膜組織中僅檢測(cè)到金屬蛋白酶，而且被證實(shí)為組織中激活炎性細(xì)胞(PMN)所釋放的MMP-9，因而推測(cè)是致病真菌產(chǎn)生少量的絲氨酸蛋白酶，PMN和角膜細(xì)胞釋放大量的MMP-9，進(jìn)而導(dǎo)致角膜基質(zhì)降解［10］，目前其他角膜致病真菌尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)茄病鐮刀菌ALP基因構(gòu)建RNA干擾載體質(zhì)粒，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化茄病鐮刀菌孢子，結(jié)果顯示，經(jīng)RNA干擾載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，基因沉默株ΔALP1、ΔALP2ALPmRNA轉(zhuǎn)錄水平較標(biāo)準(zhǔn)菌株分別下降了42.77%和69.57%，顯示基因沉默菌株mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)。對(duì)RNA干擾后基因沉默菌株酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，各基因沉默株相應(yīng)ALP對(duì)底物分解能力受到了不同程度的抑制，酶活性均有明顯下降，這提示我們干擾后的茄病鐮刀菌株的毒力有可能減弱。從酶活性檢測(cè)結(jié)果看，ΔALP2株的廓清環(huán)明顯小于標(biāo)準(zhǔn)菌株與ΔALP1株，其CH值與后兩者比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q=5.276、5.463，P＜0.01)。綜合mRNA和酶活性分析兩者檢測(cè)結(jié)果，ΔALP2菌株所取得的基因沉默效果更佳。ALP基因沉默茄病鐮刀菌株的獲取將有助于深入研究鐮刀菌的基因功能，對(duì)與茄病鐮刀菌侵襲性相關(guān)的基因進(jìn)行有針對(duì)性的單一干預(yù)操作可為闡明真菌性角膜炎發(fā)病機(jī)制、尋找嶄有效的治療措施開(kāi)辟新的途徑。

［1］Mouyna I，Sarfati J，Recco P，et al.Molecular characterization of a cell wall-associated beta(1-3)endoglucanase ofAspergillus fumigatus［J］.Med Mycol，2002，40(5):455-464.

［2］Mukherjee PK，Seshan KR，Leidich SD，et al.Reintroduction of the PLB1 gene intoCandida albicansrestores virulence in vivo［J］.Microbiology，2001，147(Pt9):2585-2597.

［3］梁濤.RNA干擾曲霉菌ALP、PLB基因表達(dá)治療真菌性角膜炎的實(shí)驗(yàn)研究［D］.青島:青島大學(xué)眼科學(xué)，2010.

［4］徐赤宇，溫海，王溪濤，等.新型隱球菌的細(xì)胞外蛋白水解酶及絲氨酸蛋白酶活性檢測(cè)［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27(2):125-128.

［5］Price MF，Wilkinson ID，Gentry LO.Plate method foe detection of phospholipase activity inCandida albicans［J］.Sabouraudia，1982，20(1):7-14.

［6］王麗婭，張?jiān)虑?，王印其，?中國(guó)三地區(qū)真菌性角膜病致病菌種的調(diào)查［J］.中華眼科雜志，2000，36(2):8-12.

［7］賀燚，孫秉基，趙東卿，等.真菌性角膜炎的臨床特征及療效觀察［J］.中華眼科雜志，2000，36(5):358-361.

［8］Iadarola P，Lungarella G，Martorana PA，et al.Lung injury and degradation of extracellular matrix components byAspergillus fumigatusserine proteinase［J］.Exp Lung Res，1998，24(3):233-251.

［9］Zhu WS，Wojdyla K，Donlon K，et al.Extracellular proteases ofAspergillus flavus.Fungal keratitis，proteases，and pathogenesis［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，1990，13(6):491-497.

［10］Gopinathan U，Ramakrishna T，Willcox M，et al.Enzymatic，clinical and histologic evaluation of corneal tissues in experimental fungal keratitis in rabbits［J］.Exp Eye Res，2001，72(4):433-442.