張晉卿 劉偉 譚靜文 萬(wàn)喆 李若瑜

(北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌與真菌病研究中心 皮膚病分子診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100034)

侵襲性曲霉病 (invasive aspergillosis，IA)是一種嚴(yán)重威脅生命的疾病，在白血病和骨髓移植受者等免疫受損機(jī)體中病死率超過(guò)90%［1］。煙曲霉是引起IA的最主要致病菌，約占90%［2］，目前其對(duì)人體的致病機(jī)制尚不清楚［3-4］。無(wú)論是在外界環(huán)境中還是進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，煙曲霉都面臨生存環(huán)境的變化，這些變化統(tǒng)稱(chēng)為應(yīng)激［5-6］，其中生存環(huán)境溫度的變化是煙曲霉面臨的最基本的應(yīng)激。溫度是影響微生物生長(zhǎng)的重要因素之一，不同物種對(duì)環(huán)境溫度變化具有不同的適應(yīng)能力［7］。煙曲霉被認(rèn)為是一種耐熱真菌，這種特性使其對(duì)環(huán)境變化的抵抗力更強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)，在30～42℃間，煙曲霉都能較好的生長(zhǎng)［8］，此外，在對(duì)肥料發(fā)酵的研究中發(fā)現(xiàn)，煙曲霉能抵御60～80℃高溫［9］。但是，對(duì)于煙曲霉耐受高溫的程度在以往研究中并沒(méi)有確切的描述。

本研究通過(guò)測(cè)定煙曲霉在不同溫度下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)及其在更高溫度下的存活率，確定煙曲霉的最適生長(zhǎng)溫度、最高生長(zhǎng)溫度及致死溫度，從而對(duì)煙曲霉耐高溫生長(zhǎng)的生理學(xué)特性有更準(zhǔn)確的認(rèn)識(shí)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株來(lái)源 煙曲霉AF293(分離自1例IA患者，美國(guó)德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心Dimitrios P.Kontoyiannis教授惠贈(zèng))和DAL(法國(guó)巴斯德研究院Jean-Paul Latgé教授惠贈(zèng))均為基因組測(cè)序菌株。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (Potato Dextrose Agar Medium，PDA.Difco Laboratories，Detroit，USA)上37℃活化 5 ～7 d。

1.2 方法

不同培養(yǎng)基對(duì)煙曲霉生長(zhǎng)的影響 取37℃生長(zhǎng)5～7 d的煙曲霉孢子，用0.1%Tween80緩沖液制成菌懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度為1×106cells/mL。繼續(xù)用0.1%Tween80緩沖液稀釋孢子，使終濃度為2×104cells/mL。配制2倍濃度酵母浸膏 (yeast extract medium，YG)、酵母氮源基礎(chǔ) (yeast nitrogen base，YNB;Difco Laboratories，Amsterdam，The Netherlands)和曲霉基礎(chǔ) (minimal medium，MM)液體培養(yǎng)基，加入96孔板，每孔100 μL。加入上述菌懸液100 μL/孔，使每孔中孢子濃度為 1 × 104cells/mL［10］。對(duì) 照 組 加 入 0.1%Tween80緩沖液100 μL/孔。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均設(shè)8孔重復(fù)。將96孔板放入37℃溫箱，間隔一定時(shí)間用吸收光酶標(biāo)儀 (BioTek，美國(guó))測(cè)量405 nm吸光度，連續(xù)測(cè)量96 h，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)3次。如果兩菌株間數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則合并數(shù)據(jù)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn);如果二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則分別繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

溫度對(duì)煙曲霉生長(zhǎng)的影響 生長(zhǎng)曲線(xiàn)法:方法同上，溫度設(shè)定以菌株獲得最快生長(zhǎng)的溫度為基礎(chǔ)并參考文獻(xiàn)中報(bào)道的煙曲霉能夠生長(zhǎng)的最高溫度［8-9］，如果菌株在此溫度仍能生長(zhǎng)，則升高溫度2℃，直至獲得斜率最低的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，對(duì)應(yīng)的溫度為菌株最高生長(zhǎng)溫度。菌落計(jì)數(shù)法:取37℃生長(zhǎng)5～7 d的煙曲霉孢子，用0.1%Tween80緩沖液制成菌懸液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度為1×106cells/mL。連續(xù)稀釋孢子濃度為1×103cells/mL。取100 μL菌懸液均勻涂布于酵母浸膏固體培養(yǎng)基(yeast extract agar medium，YAG)上，給予不同溫度刺激 (65℃，70℃)一定時(shí)間后 (0 min，15 min，30 min，45 min，60 min，75 min，90 min，105 min，120 min，150 min及180 min)，將平皿轉(zhuǎn)移至37℃溫箱繼續(xù)孵育20～24 h，計(jì)數(shù)菌落個(gè)數(shù)并繪制活力曲線(xiàn)，最終確定煙曲霉的致死溫度。每次實(shí)驗(yàn)在同一條件下設(shè)三個(gè)平行對(duì)照，實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)3次。如果兩菌株間數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則合并數(shù)據(jù)繪制活力曲線(xiàn);如果二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則分別繪制活力曲線(xiàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩菌株間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 YG是測(cè)定煙曲霉生長(zhǎng)曲線(xiàn)的最適宜培養(yǎng)基

煙曲霉在YG培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期約開(kāi)始于12～20 h，到約60 h時(shí)進(jìn)入第二生長(zhǎng)過(guò)渡期;在YNB培養(yǎng)基中菌株直到約60 h時(shí)才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但進(jìn)入此期后生長(zhǎng)速度較快;在MM培養(yǎng)基中，菌株生長(zhǎng)最慢 (見(jiàn)圖1)。

2.2 煙曲霉溫度生長(zhǎng)曲線(xiàn)的確定

根據(jù)上述結(jié)果，YG培養(yǎng)基最適宜用來(lái)觀察溫度對(duì)煙曲霉生長(zhǎng)的影響。由煙曲霉在不同溫度下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)可知，在YG培養(yǎng)基中，37℃是煙曲霉的最適宜生長(zhǎng)溫度，52℃為其最高生長(zhǎng)溫度，當(dāng)溫度為54℃時(shí)，菌株無(wú)可見(jiàn)生長(zhǎng) (見(jiàn)圖2a，2b)。隨著溫度的升高，菌株的生長(zhǎng)速度逐漸減慢，但兩株煙曲霉菌株對(duì)高溫的反應(yīng)不完全一致。煙曲霉AF293在48℃時(shí)較37℃生長(zhǎng)明顯緩慢，96 h時(shí)菌株仍未進(jìn)入第二生長(zhǎng)過(guò)渡期 (見(jiàn)圖2a);而煙曲霉DAL雖然在48℃時(shí)較37℃更晚進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后生長(zhǎng)速度較快，且與37℃菌株幾乎同時(shí)進(jìn)入第二生長(zhǎng)過(guò)渡期 (見(jiàn)圖2b)。

此外我們還發(fā)現(xiàn)，雖然煙曲霉在高于52℃的環(huán)境下幾乎無(wú)可見(jiàn)生長(zhǎng)，但仍然保持活力，在54℃孵育96 h后轉(zhuǎn)入37℃，菌株能獲得與孵育在37℃的菌株一樣的生長(zhǎng)。

2.3 煙曲霉致死溫度的確定

當(dāng)兩株煙曲霉菌株的孢子在65℃下刺激的時(shí)間＜60 min時(shí)，仍有80%以上的孢子能形成菌落;當(dāng)刺激時(shí)間為75 min時(shí)，有約50%的孢子能形成菌落;而當(dāng)刺激180 min后，所有孢子都無(wú)法形成菌落，菌株不可逆失活。70℃刺激使孢子失活的時(shí)間更短，刺激120 min后，菌株即不可逆失活 (見(jiàn)圖3)。

3 討 論

絲狀真菌的生長(zhǎng)可分為5個(gè)階段，分別是靜止期、第一過(guò)渡期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、第二過(guò)渡期及穩(wěn)定期。在第一過(guò)渡期時(shí)，孢子開(kāi)始腫脹發(fā)芽，但菌絲延長(zhǎng)不明顯，生長(zhǎng)曲線(xiàn)較平滑，表現(xiàn)出緩慢上升趨勢(shì);當(dāng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最快，生長(zhǎng)曲線(xiàn)達(dá)到最大斜率;當(dāng)處于第二過(guò)渡期時(shí)，菌絲延伸速度下降，生長(zhǎng)曲線(xiàn)斜率下降，再次變得平滑［10］。生長(zhǎng)曲線(xiàn)能夠直觀的反映出絲狀真菌的生長(zhǎng)情況，因此，我們應(yīng)用生長(zhǎng)曲線(xiàn)法評(píng)價(jià)煙曲霉的生長(zhǎng)狀況。我們選用了三種研究曲霉生理特性時(shí)較常用的培養(yǎng)基:YG培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，除了必需成分外，還含有微量元素和維生素，特別利于菌株生長(zhǎng);MM培養(yǎng)基成分與察氏培養(yǎng)基類(lèi)似，但嚴(yán)格限定了pH值，在研究不同營(yíng)養(yǎng)成分、不同酸堿環(huán)境對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響時(shí)可以精確改變營(yíng)養(yǎng)條件;YNB培養(yǎng)基中無(wú)碳源，可以用來(lái)研究菌株對(duì)不同碳源的利用情況。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，相同溫度下，YG培養(yǎng)基中測(cè)得的生長(zhǎng)曲線(xiàn)能更完整的反映出煙曲霉的生長(zhǎng)周期，最適宜用來(lái)觀察溫度對(duì)煙曲霉生長(zhǎng)的影響。

圖1 兩株煙曲霉菌株在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線(xiàn)(MM.曲霉基礎(chǔ)培養(yǎng)基，YNB.酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基，YG.酵母浸膏培養(yǎng)基) 圖2 煙曲霉在不同溫度下的生長(zhǎng)曲線(xiàn):a.AF293，b.DAL 圖3 兩株煙曲霉菌株在高溫下的活力曲線(xiàn)Fig.1 The growth curves of Aspergillus fumigatus in different nutrient media(MM.minimal medium，YNB.yeast nitrogen base medium，YG.yeast extract medium) Fig.2 The growth curves of Aspergillus fumigatus at different temperatures Fig.3 Colony counts of Aspergillus fumigatus at high temperatures

雖然研究普遍認(rèn)為煙曲霉是一種耐熱真菌，但對(duì)其耐受高溫的程度，并沒(méi)有確切的描述。我們發(fā)現(xiàn)，在YG培養(yǎng)基中，煙曲霉的最適宜生長(zhǎng)溫度為37℃，在此溫度下其生長(zhǎng)最好。這也是煙曲霉容易感染人體的一個(gè)重要原因。當(dāng)溫度達(dá)到48℃時(shí)，煙曲霉的生長(zhǎng)受到一定程度的抑制，但在不同菌株中情況并不完全一致:在AF293中觀察到，菌株的生長(zhǎng)受到明顯的抑制，第一生長(zhǎng)過(guò)渡期延長(zhǎng)，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間延長(zhǎng)，生長(zhǎng)曲線(xiàn)斜率較37℃明顯下降;而在DAL中卻觀察到，雖然菌株第一生長(zhǎng)過(guò)渡期延長(zhǎng)，但進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，菌株的生長(zhǎng)并未減緩。當(dāng)溫度達(dá)到52℃時(shí)，兩株煙曲霉菌株均表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)受抑，生長(zhǎng)曲線(xiàn)斜率最小。以往關(guān)于真菌對(duì)溫度耐受的研究中，多集中于30℃到37℃或42℃的溫度改變引起的轉(zhuǎn)錄水平或蛋白水平的變化［11］。由于煙曲霉是一種耐熱真菌，研究發(fā)現(xiàn)30～37℃的溫度改變不足以引起其與毒力相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生改變［12］。因此，其后對(duì)煙曲霉熱休克反應(yīng)的研究多將刺激溫度選為48℃［13-14］。但是我們發(fā)現(xiàn)，煙曲霉菌株在48℃時(shí)仍具有良好的生長(zhǎng)能力，并且不同的菌株對(duì)48℃的反應(yīng)不完全一致;當(dāng)溫度達(dá)到52℃時(shí)，兩株煙曲霉才表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)受抑。該結(jié)果提示，在煙曲霉對(duì)高溫耐受的研究中，應(yīng)該選擇52℃作為刺激條件。

既往研究認(rèn)為煙曲霉能夠耐受肥堆的高溫發(fā)酵階段［9］，但其致死溫度不清楚。因此，本研究還測(cè)定了煙曲霉菌株的致死溫度;致死溫度指一定條件下和一定時(shí)間內(nèi)殺死微生物的最低溫度［15］。我們發(fā)現(xiàn)，65℃持續(xù)刺激180 min或70℃刺激120 min可完全殺死煙曲霉。由于高于70℃的溫度會(huì)使固體培養(yǎng)基熔化，因此我們無(wú)法得到高于70℃時(shí)煙曲霉的致死條件。這有待于在將來(lái)的研究中改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法以闡明。

本研究中得到的煙曲霉最適生長(zhǎng)溫度、最高生長(zhǎng)溫度及致死溫度雖然具有一定的代表性，但仍需在未來(lái)研究中擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證;我們的結(jié)果也提示，無(wú)論是以標(biāo)準(zhǔn)菌株還是臨床菌株為研究對(duì)象，都需要預(yù)先了解該菌株的生理特性，以合理選擇實(shí)驗(yàn)條件。

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