李麗娟,張德生,莊朋偉,張艷軍,張密霞

(天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 300193)

近期研究[1]表明,不同人群粒細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力不同,而且隨著年齡增加,粒細(xì)胞活力逐漸下降,腫瘤患者的粒細(xì)胞表現(xiàn)為極弱的腫瘤細(xì)胞殺傷能力。崔正等[2]報(bào)道,腫瘤自然消退/完全消退(SR/CR)小鼠的粒細(xì)胞能抵抗多種類型的癌細(xì)胞,使腫瘤產(chǎn)生自發(fā)消退和/或其中性粒細(xì)胞體外能在腫瘤細(xì)胞周圍形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu),并殺死瘤細(xì)胞/移植SR/CR 小鼠粒細(xì)胞至普通小鼠,普通小鼠可獲得抗腫瘤能力。當(dāng)機(jī)體發(fā)生細(xì)菌感染時(shí)白細(xì)胞可被激活,而細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖是激活白細(xì)胞的主要物質(zhì),真菌多糖可提高機(jī)體的細(xì)胞免疫及體液免疫水平[3],故推測(cè)某些真菌類多糖可能能通過(guò)提高粒細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力從而發(fā)揮防治腫瘤作用。茯苓多糖具有調(diào)節(jié)固有免疫和抗腫瘤作用[4]。本實(shí)驗(yàn)從大鼠全血分離中性粒細(xì)胞,經(jīng)茯苓多糖作用后加入體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞,通過(guò)觀察中性粒細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞周圍形成玫瑰花環(huán)樣結(jié)構(gòu)的比例,探討茯苓多糖體外激活中性粒細(xì)胞從而抗腫瘤的活性,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要試劑與儀器 DT-500(Pharmacia 公司,Lot.No.307041);Ficoll 分離液(Pharmacia 公司,Lot.No.10038229);胎牛血清(Bioind 公司);RPMI 1640(Sigma公司,Lot.No.688600)。RT-PCR 試劑盒(大連寶生物)。核酸蛋白分析儀(Beckman,Du530);基因擴(kuò)增儀(Hybaid limited Equipment Class,PE-480);凝膠成像分析儀(Bio Image system Gene Company,Gene Genius);茯苓多糖提取物粉末,天津中醫(yī)藥大學(xué)趙駿老師提供;Bel-7402 細(xì)胞株,上海潤(rùn)成生物科技有限公司;SD 大鼠:天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 大鼠PMNs 的分離[5]5月齡大鼠1 只,乙醚麻醉,腹主動(dòng)脈取血8 mL,加入肝素抗凝的試管中,再加入等體積的6%DT-500,混勻,37℃靜置40 min,取上清,加等體積生理鹽水,1 800 rpm 離心10 min,棄上清,加少量生理鹽水重懸后加至裝有Ficoll 的離心管上層,2 000 rpm 離心18 min,取PMNs 層,生理鹽水洗滌,臺(tái)盼藍(lán)染色,活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)95%以上。

1.3 人肝癌細(xì)胞株Bel-7402 培養(yǎng) 將Bel-7402 細(xì)胞株以含10%胎牛血清(FBS),1%青、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液接種于75 cm2培養(yǎng)瓶,細(xì)胞密度為5×104/mL,隔天換液。待細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí),以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA 等體積組成的消化液消化傳代,以含10%FBS、1%青、鏈霉素RPMI1640培養(yǎng)液重懸,調(diào)整濃度為1×104/mL,種于6 孔板,每孔2 mL,每組3 復(fù)孔,培養(yǎng)24 h 備用。

1.4 茯苓多糖對(duì)PMNs 活性的影響 將分離出的PMNs 以8×105個(gè)/孔接種于6 孔板,加入茯苓多糖,使其終濃度分別為 62.5、31.25、15.625、7.813、3.906 μg/mL,以等量全培養(yǎng)基作對(duì)照。作用2 h 后離心,棄上清,用1 mL 全培養(yǎng)基重懸后加入預(yù)先培養(yǎng)有Bel-7402 的6 孔板。共培養(yǎng)4 h 后,在倒置相差顯微鏡下觀察,每孔隨機(jī)取10 個(gè)10×10 倍視野,照像并計(jì)數(shù)PMNs 在Bel-7402 細(xì)胞周圍形成玫瑰花環(huán)形態(tài)的比例,以3 個(gè)或3 個(gè)以上PMNs 圍繞在一個(gè)Bel-7402 周圍計(jì)為一個(gè)玫瑰花環(huán)。

1.5 茯苓多糖對(duì)PMNs 黏附相關(guān)基因表達(dá)的影響將原代分離的PMNs 以1×106/mL 種于6 孔板,分為空白PMNs 對(duì)照組(全培養(yǎng)基孵育2 h)和茯苓多糖激活PMNs組(7.813 μg/mL 茯苓多糖孵育2 h),每組3復(fù)孔。2 h 后1 500 rpm 離心5 min,棄上清,每孔加1 mL Trizol 提取總RNA,RT-PCR 法檢測(cè)黏附相關(guān)基因TLR-4、CD11b、CD18、MyD88、MAPK-3、NF-κb 等mRNA 的表達(dá)。

引物序列根據(jù)Primer3 軟件設(shè)計(jì),經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè),由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。序列如下:β-actin:上游AGCCATGTACGTAGCCATCC,下游TC TCAGCTGTGGTGGTGAAG(227bp);TLR-4 上游CAGGG AATTAGGCTCCATGA,下游TCCATGACAGAACGGTCAA A(164bp);MyD88 上游GAGATCCGCGAGTTTGAGAC,下游CTGTTTCTGCTGGTTGCGTA(192bp);MAPK-3 上游ATGAAGGCCCGAAACTACCT,下游ATCCAGCTCCATGTCAAAGG(237bp);NF-κb 上 游GCTTTGCAAACCTGGGAATA,下游TCAGGTCCATCTCCTTGGTC(:225 bp);CD11b 上游CATCACCGTGAGTTCCACAC,下游GAGAACTGGTTCTGGCTTGC (174bp);CD18:上游AGTCCCAGTGGAACAACGAC,下 游 GCACTGGGGCTAGCTGTAAG(161bp)。反應(yīng)條件:94℃,2 min,1cycle;94℃,30sec,58℃,30sec,72℃,30sec,(其中βactin 擴(kuò)增28 cycles,其余38 cycles)。瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像分析儀上應(yīng)用BIO IMAGING SYSTEM(SYNGENE)照像,以目的基因β-actin 灰度比值進(jìn)行半定量比較分析。計(jì)算方法:目的基因灰度比值=目的基因灰度值/β-actin 灰度值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行組間比較,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同濃度茯苓多糖對(duì)PMNs 活性的影響 見表1。

表1 不同濃度茯苓多糖對(duì)PMNs 活性的影響()

表1 不同濃度茯苓多糖對(duì)PMNs 活性的影響()

注:與對(duì)照組比較,#P ＜0.05。

2.2 茯苓多糖對(duì)離體PMNs 黏附相關(guān)基因表達(dá)的影響 見表2。

表2 茯苓多糖對(duì)離體PMNs 黏附及活化相關(guān)基因表達(dá)的影響()

表2 茯苓多糖對(duì)離體PMNs 黏附及活化相關(guān)基因表達(dá)的影響()

注:與對(duì)照組比較,#P ＜0.05。

從表2 可以看出,與對(duì)照組比較,茯苓多糖可以增加PMNs 黏 附相 關(guān) 基因TLR-4、MyD88、NF-κB、CD11bmRNA 的表達(dá)。

3 討論

慢性炎癥與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),慢性炎癥可導(dǎo)致腫瘤形成,炎細(xì)胞的募集也可能抗腫瘤產(chǎn)生和腫瘤進(jìn)展。研究[6]認(rèn)為,細(xì)胞因子的平衡調(diào)節(jié)影響炎癥浸潤(rùn)的類型和數(shù)量及腫瘤進(jìn)程:腫瘤產(chǎn)生少量或不產(chǎn)生細(xì)胞因子或產(chǎn)生過(guò)量抗炎因子,限制炎癥反應(yīng)和血管形成,限制腫瘤生長(zhǎng);產(chǎn)生大量的促炎癥因子導(dǎo)致炎癥反應(yīng)達(dá)到增加血管新生的地步,則促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng);抗炎和促炎因子失衡,導(dǎo)致大量單核細(xì)胞或中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤時(shí),可有細(xì)胞毒和血管新生停滯,結(jié)果腫瘤萎縮

為探討茯苓多糖提高PMNs 對(duì)腫瘤細(xì)胞趨化黏附作用的機(jī)制,檢測(cè)了PMNs 炎癥相關(guān)因子TLR-4、MyD88、NF-κB、CD11b、CD18mRNA 的表達(dá)。TLR4 是LPS 的跨膜受體,被LPS 激活后可激活MyD88 依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,誘導(dǎo)炎癥基因如NF-κB、TNF-α、MAPK等的表達(dá),誘導(dǎo)免疫反應(yīng)發(fā)生。Mac-1 是位于白細(xì)胞表面的黏附分子,由CD11b 和CD18 2 個(gè)亞基組成。吞噬細(xì)胞上的CD11b/CD18 對(duì)iC3b 調(diào)理的細(xì)胞毒性反應(yīng)需依賴病原體多糖與CD11b 結(jié)合,使CD11/CD18 致敏才能觸發(fā),這些多糖常含甘露糖、葡萄糖等糖基。而iC3b 調(diào)理的腫瘤細(xì)胞缺乏適宜的多糖刺激,必須依賴外源性多糖的參與,才能使CD11b/CD18致敏[8]。茯苓多糖主要含巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖[9],它有可能致敏CD11b/CD18,觸發(fā)吞噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖能增加PMNs TLR-4、MyD88、NF-κB 及CD11bmRNA 表達(dá),這可能是其促進(jìn)白細(xì)胞黏附于腫瘤細(xì)胞的機(jī)制之一?？傊?本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖可以增加PMNs活性,提高PMNs 對(duì)腫瘤的趨化黏附作用,其機(jī)制與增加PMNs 黏附 相關(guān) 基因TLR-4、MyD88、NF-κB、CD11bmRNA 的表達(dá)相關(guān)。

[1]高艷紅,董矜,田亞平.具有抗腫瘤特性的中性粒細(xì)胞的篩選技術(shù)[J].標(biāo)記免疫分析與臨床,2009,16(5):298-300.

[2]Cui Z,Willingham MC,Hicks AM,et al.Spontaneous regression of advanced Cancer:identification of a unique genetically determined,age-dependent trait in mice[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(11):6682-6687.

[3]張誠(chéng),趙慧群,劉江成,等.食藥用真菌的生物活性概述[J].吉林中醫(yī)藥,2006,26(10):56-58.

[4]李慶云,張艷軍.茯苓多糖抗腫瘤機(jī)理研究[J].吉林中醫(yī)藥,2010,30(4):345-347.

[5]張艷軍.活血化瘀注射液對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞黏附率的影響[J].天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,20(2):20-22.

[6]Coussens L M,Werb Z.Inflammation and Cancer[J].Nature,2002,420(6917):860-867.

[7]況榮華,周林,傅穎珺.中藥以LPS-TLR4 為作用靶點(diǎn)的抗炎機(jī)制的研究進(jìn)展[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2011,51(10):89-92.

[8]刁飛,朱曉燕,劉宇健.Mac-1 的結(jié)構(gòu)與功能及其在腫瘤免疫治療中的作用[J].中國(guó)癌癥雜志,2006,16(3):232-234.

[9]黃燦,王玉明,趙駿.抗腫瘤活性茯苓多糖的提取、純化與結(jié)構(gòu)分析[J].中草藥,2012,43(11):2146-2149.