張丹麗，田雪，董常生

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷030801）

c－myc是在MC29鳥類轉(zhuǎn)錄病毒中被證實(shí)的具有轉(zhuǎn)化作用的癌基因，為myc基因家族成員之一，定位于人類染色體8q24［1］，其編碼的c－myc蛋白由439個(gè)氨基酸殘基組成［2］。c－myc為螺旋環(huán)螺旋／亮氨酸拉鏈家族的DNA結(jié)合蛋白，通過與Max作用，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡等重要生理功能［3］。研究表明c－myc高表達(dá)于脈絡(luò)膜惡性黑色素瘤細(xì)胞中并可作為其診斷依據(jù)［1］。國內(nèi)外已有學(xué)者對(duì)一些物種的c－myc與毛發(fā)發(fā)育等方面進(jìn)行過研究［4，5］。羊駝為毛用型經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，具有22種遺傳穩(wěn)定的自然毛色，是研究毛用動(dòng)物毛色形成機(jī)制的理想型材料［6，7］。c－myc是否在羊駝皮膚組織中表達(dá)，它與羊駝毛色形成過程的關(guān)系如何，尚未有研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬研究c－myc在羊駝皮膚中的定位，并通過檢測(cè)其在不同毛色羊駝皮膚中的蛋白表達(dá)情況，探索c－myc與毛色形成的關(guān)系，以期為c－myc參與毛色形成調(diào)控機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料

隨機(jī)挑選3歲左右的棕色和白色雄性青年羊駝各3只，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝養(yǎng)殖基地提供。剃毛后用取皮器取1cm2左右皮膚組織1塊，置于Bouin’s固定液中固定，石蠟包埋后制成切片，用于免疫組織化學(xué)分析。

1．2 主要試劑和儀器

兔抗c－myc多克隆抗體，HRP－山羊抗兔IgG均購自北京博奧森生物技術(shù)公司；DAB顯色試劑盒購自武漢博世德生物工程有限公司。

1．3 免疫組織化學(xué)方法

將固定于Bouin’s固定液中的組織取出，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、修塊、切片，制成5μm厚的石蠟切片。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫水，用3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS清洗3次（每次5min）。滴加封閉液，室溫放置20min。甩掉封閉液，滴加1∶80稀釋的一抗，室溫放置30 min后4℃過夜。取出后，室溫放置30min，PBS清洗后滴加二抗，37℃孵育20min。PBS清洗，滴加DAB顯色液顯色5～10min。PBS清洗，蘇木精輕度復(fù)染，脫水、透明后，中性樹膠封片。PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

光鏡下觀察切片，每只羊駝取3張切片，每張切片用DP軟件采集5個(gè)視野，對(duì)染色結(jié)果用Image－Pro Plus6．0軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)定陽性反應(yīng)物的平均光密度，進(jìn)行吸光度分析。分析結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）表示。

2 結(jié)果和分析

免疫組織化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可見，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在棕色和白色羊駝皮膚組織切片中，毛囊毛球部細(xì)胞中存在c－myc蛋白棕黃色陽性反應(yīng)，著色深淺不等，對(duì)照組未觀察到陽性細(xì)胞。對(duì)c－myc蛋白在不同毛色羊駝皮膚組織中的陽性細(xì)胞的平均光密度值進(jìn)行測(cè)定比較（表1），結(jié)果顯示，c－myc在棕色和白色羊駝皮膚組織中陽性細(xì)胞的表達(dá)量差異極顯著（P＜0．01）。

圖1 羊駝皮膚組織c－myc免疫組織化學(xué)染色（放大倍數(shù)：×40）Fig．1 Expressions of c－myc protein in skin tissue of alpacas showed by immunohistochemical method（Magnification：×40）

表1 陽性表達(dá)細(xì)胞的平均光密度Table 1 Average optical density of c－myc positive cells in alpaca skin

3 討論

哺乳動(dòng)物的毛色是由黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的兩種不同類型的色素（真黑素和褐黑素）的分布及比例決定的［6］，其過程受多條信號(hào)通路調(diào)控，Wnt信號(hào)通路為其重要一條，它通過調(diào)節(jié)毛囊隆突部的毛囊干細(xì)胞與上皮細(xì)胞間的分化影響色素生成［8］。Irina［9］指出c－myc的缺失將影響黑色素干細(xì)胞的發(fā)育，使發(fā)揮正常功能的黑色素細(xì)胞數(shù)量減少。已有研究表明c－myc作為Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)下游信號(hào)分子，該通路中的重要分子β－catenin能夠通過調(diào)控 Tcf－4從而激活c－myc的表達(dá)［10］。研究發(fā)現(xiàn)在羊駝皮膚毛囊毛球部存在c－myc陽性免疫反應(yīng)物，且c－myc蛋白在棕色羊駝中表達(dá)量為白色羊駝的5．51倍，本實(shí)驗(yàn)室于秀菊等證實(shí)β－catenin在棕色羊駝皮膚中的表達(dá)量顯著高于白色羊駝［11］。這與文獻(xiàn)所述兩者量的關(guān)系相一致。由于毛球部是產(chǎn)生并直接向毛干運(yùn)輸黑色素的唯一部位［12］，因此推測(cè)β－catenin通過激活c－myc 的表達(dá)來影響羊駝毛色形成，但c－myc在羊駝毛色形成調(diào)控過程中的具體作用還有待于進(jìn)一步的研究。本研究為c－myc參與羊駝毛色形成提供了一定的理論基礎(chǔ)。

［1］于洋洋．c－myc致癌蛋白在脈絡(luò)惡性黑色素瘤中的表達(dá)與意義［J］．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，43（6）：609－614．

［2］宋建明．c－myc蛋白的分子作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］．國際病理科學(xué)與臨床雜志，1996，16（3）：151－154．

［3］Nair S K，Burley S K．X－Ray Structures of Myc－Max and Mad－Max Recognizing DNA［J］．Cell，2003，112：192－205．

［4］王寧．c－myc在小鼠毛囊形成和毛發(fā)再生過程中的作用初探［D］．第三軍醫(yī)大學(xué)，2010．

［5］郭燕燕．c－myc在毛囊胚胎發(fā)育及生長周期中作用的初步研究［D］．第三軍醫(yī)大學(xué)，2008．

［6］張俊珍，董常生，范瑞文，等．哺乳動(dòng)物毛色形成研究進(jìn)展［J］．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（增）：65－68．

［7］董彥君，曹靖．羊駝被皮系統(tǒng)組織學(xué)研究進(jìn)展［J］．畜牧獸醫(yī)科技信息，2008，（2）：7．

［8］Rabbani P，Takeo M，Chou W，et al．Coordinated activation of wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration［J］．Cell，2011，145（6）：941－955．

［9］Irina Pshenichnaya，Karine Schouwey，Marzia Armaro，et al．Constitutive gray hair in mice induced by melanocyte－specific deletion of c－myc［J］．Pigment Cell Melanoma Res，2012，25（3）：312－325．

［10］Tong－Chuan He，Andrew BS，Carlo Rago，et al．Identification of c－myc as a Target of the APC Pathway［J］．Science，1998，281（5382）：1509－1512．

［11］于秀菊，董常生，范闊海，等．β－catenin在不同毛色羊駝皮膚中的表達(dá)和定位［J］．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41（3）：335－340．

［12］Slominsik A，Wortsman J，Plonka P M，et a1．Hair follicle pigment［J］．Journal of Investigative Dermatology，2005，124（1）：13－21．