楊子善 謝云飛 解博紅 任太芳 王永淑 豐慧根 劉世饒 馬振玲 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南省“遺傳性疾病與分子靶向藥物”高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，新鄉(xiāng)453003)

錨蛋白重復(fù)序列(Ankyrin repeat，ANK)是最常見的一種介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的蛋白模體，常與 F-box、鋅指、PDZ(PSD-95/Dlg/ZO-1)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域和蛋白激酶等結(jié)構(gòu)域共存，其中F-box與蛋白質(zhì)泛素化密切相關(guān)［1-3］。RING(Really interesting new gene)結(jié)構(gòu)域則是E3泛素連接酶中最常見的結(jié)構(gòu)域，大部分含RING結(jié)構(gòu)域的蛋白具有E3連接酶活性［4］。

含錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域和IBR結(jié)構(gòu)域蛋白1(Ankyrin repeat and IBR domain-containing protein 1，ANKIB1)又稱KIAA1386，由1 089個(gè)氨基酸殘基組成，含有豐富的結(jié)構(gòu)域和模體，其中包括RING-IBRRING(RBR)結(jié)構(gòu)域、ANK模體和泛素結(jié)合模體(Ubiquitin-interacting motif，UIM)。RBR 由 兩 個(gè)RING結(jié)構(gòu)域和1個(gè)與RING同源的IBR(in-between RING)結(jié)構(gòu)域組成，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的12種人源RBR蛋白中，除了ANKIB1和RNF144A研究太少尚無定論，其余10種均已證明具有 E3泛素連接酶活性［5］。因此，ANKIB1極可能因?yàn)镽BR結(jié)構(gòu)域的存在而具有E3泛素連接酶活性，或者是E3連接酶復(fù)合體的一部分。ANKIB1是唯一含有ANK和UIM結(jié)構(gòu)的RBR蛋白，UIM廣泛參與泛素分子的轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)的泛素化修飾［6］，兩種模體很可能賦予ANKIB1特殊的修飾途徑和分子機(jī)制。然而ANKIB1發(fā)現(xiàn)十多年來，相關(guān)研究報(bào)道極少，目前僅知的功能是其UIM能夠結(jié)合泛素和促進(jìn)S5a蛋白的泛素化［7，8］。Muscarella 等［9］在一個(gè)腦海綿狀血管瘤(CCM)家族中發(fā)現(xiàn)，全部3個(gè)病人的同一條染色體缺失ANKIB1基因90%的序列，但ANKIB1基因與CCM是否有關(guān)尚需進(jìn)一步研究。

為了探索ANKIB1的表達(dá)、功能和分子機(jī)制，我們在大腸桿菌中表達(dá)和純化了ANKIB1重組蛋白，并通過雜交瘤技術(shù)制備了ANKIB1單克隆抗體，為ANKIB1的研究提供了有效的工具。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 主要試劑 Pyrobest DNA聚合酶購自大連寶生物公司，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和Xa因子購自NEB公司，質(zhì)粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自上海生工。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購自天根生化科技公司，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自 Fermentas公司。Glutathione Sepharose 4B凝膠購自GE Healthcare公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和PEG3500購自Sigma公司，HAT和 HT購自Biological Industry公司，抗體純化試劑盒購自萬華士(北京)生物科技有限公司，抗體分型試劑盒購自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，兔抗人c-myc單克隆抗體(#2278)購自Cell Signaling Technology公司，兔抗人GST(谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶)抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ECL試劑盒購自Thermo scientific公司。RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清和胰酶購自Gibco公司，GenEscortⅡ轉(zhuǎn)染試劑購自南京慧基生物技術(shù)有限公司。質(zhì)粒pGEX-5X-3和pCMV-Myc為本實(shí)驗(yàn)室保存，包含人ANKIB1基因部分或全長CDS的質(zhì)粒pEGFP-N1-ANKIB1Δ3和pCMV-Myc-ANKIB1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1．1．2 菌株、細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人胚胎 大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保存。HEK293ET細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系王輝教授惠贈(zèng)，BALB/c小鼠由河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)院王選年教授惠贈(zèng)，昆明系小白鼠和SD大鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。不可避免流產(chǎn)人胚胎經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)采集。

1．2 方法

1．2．1 表達(dá)載體的構(gòu)建 按照姊妹PCR克隆法［10］構(gòu)建表達(dá)載體 pCMV-Myc-ANKIB1(1-480)和pGEX-5X-ANKIB1(1-480)。PCR以表達(dá)人ANKIB1蛋白(Q9P2G1，1089 aa)1-741氨基酸殘基的pEGFP-N1-ANKIB1Δ3為模板，4條引物的序列分別為ANK-FL:5'-GATCTCCATGGGAAATACAACC-3'，ANK-FS:5'-TCCATGGGAAATACAACC-3'，ANK-RL:5'-GGCCGCTCATGTTTGGCAGTCACAAG-3'，ANK-RS:5'-GCTCATGTTTGGCAGTCACAAG-3'。ANKIB1(1-480)在質(zhì)粒pCMV-Myc和pGEX-5X-3中的克隆位點(diǎn)分別是BglⅡ/NotⅠ和BamH Ⅰ/NotⅠ，DNA測序確認(rèn)插入片段的序列。

1．2．2 GST 和 GST-ANKIB1(1-480)在大腸桿菌中的表達(dá)和純化 取pGEX-5X-3和pGEX-5XANKIB1(1-480)分別轉(zhuǎn)化E．coli BL21(DE3)，然后分別挑取單克隆接種于3 ml 2×YTA培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。取過夜培養(yǎng)菌液，按1∶100的比例分別接種到50～100 ml預(yù)熱的2×YTA培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)使A600達(dá)到0．6 ～0．8，加入IPTG 至終濃度0．1 mmol/L，20℃培養(yǎng)5小時(shí)。離心收集菌體，加入STE(150mmol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl，pH7.5，1 mmol/L EDTA，100 μg/ml 溶菌酶，3%Triton X-100)裂解緩沖液，超聲波破碎，4℃ 12 000 r/min離心10分鐘，收集上清。利用 Glutathione sepharose 4B親和層析柱分別純化GST和GSTANKIB1(1-480)重組蛋白，使用PBS透析去除谷胱甘肽，SDS-PAGE分析蛋白純度，BCA法測定蛋白濃度。

1．2．3 小鼠免疫和陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選 選擇3只8周齡雌性BALB/c健康小鼠，取純化的GST-ANKIB1(1-480)重組蛋白腹腔注射免疫小鼠(100 μg/只)。經(jīng)過3次免疫后尾靜脈采血，ELISA測定血清效價(jià)，選擇ELISA效價(jià)高于1∶10 000的小鼠進(jìn)行沖擊免疫。3天后眼眶采血，取脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合，使用PEG法融合［11］。加入含有20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，100 μl/孔分配到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中培養(yǎng)，24小時(shí)后每孔加入100 μl含有2×HAT的完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞數(shù)量達(dá)到孔底面積的1/3時(shí)，采用間接ELISA篩選GST-ANKIB1(1-480)陽性的克隆。通過有限稀釋法連續(xù)克隆化3次，以保證獲得純凈的單克隆細(xì)胞株。采用間接ELISA篩選抗GST陰性、抗GST-ANKIB1(1-480)陽性的雜交瘤細(xì)胞株。

1．2．4 間接ELISA檢測單抗 使用純化的GST或GST-ANKIB1(1-480)包被酶標(biāo)板，加入細(xì)胞培養(yǎng)上清或腹水，37℃孵育1小時(shí)，PBST洗滌3次。加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1小時(shí)，PBST洗滌3次。加入底物和TMB顯色液，室溫顯色5～10分鐘，使用酶標(biāo)儀測定OD450。細(xì)胞融合當(dāng)天所取免疫BALB/c小鼠的血清作為陽性對照，未免疫BALB/c小鼠的血清作為陰性對照，未接種細(xì)胞培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基作為空白對照。

1．2．5 腹水制備、抗體純化和亞類鑒定 擴(kuò)大培養(yǎng)陽性雜交瘤細(xì)胞，按每只小鼠5×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞腹腔注射小鼠，10～14天后收集腹水，抗體純化和亞類鑒定按照試劑盒說明書進(jìn)行，BCA法測定抗體濃度。

1．2．6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和腦蛋白制備 使用含有2 mmol/L L-谷氨酰胺和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293ET細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于35 mm或10 cm培養(yǎng)皿中，16～24小時(shí)后按說明書轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液［150 mmol/L氯化鈉，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris-HCl，pH8．0，1% 乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)，1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，0．5 μg/ml亮抑酶肽(Leupeptin)，0．5 μg/ml胃酶抑素(Pepstatin)，1 μg/ml抑肽酶(Aprotinin)］裂解細(xì)胞，4℃ 12 000 r/min離心10分鐘收集上清。取剛出生的昆明系小白鼠和SD大鼠以及5月齡人胚胎腦組織200 mg，勻漿后分離細(xì)胞，加入RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，4℃ 12 000 r/min離心10分鐘收集上清。

1．2．7 免疫沉淀 取0．5 ml轉(zhuǎn)染過 pCMV-Myc-ANKIB1的細(xì)胞裂解液，加入2 μg ANKIB1單克隆抗體，4℃孵育2小時(shí)，然后加入蛋白G-瓊脂糖凝膠(Protein G-agarose)，4℃混合過夜。使用RIPA緩沖液漂洗3次，然后加入1×SDS上樣緩沖液煮沸洗脫。

1．2．8 Western blot 蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，浸泡于5%脫脂牛奶室溫封閉1小時(shí)。加入第一抗體(anti-GST、anti-myc或anti-ANKIB1)，室溫孵育1小時(shí)或4℃過夜。TBST洗滌3次后加入HRP標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1小時(shí)，TBST漂洗3次。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，X光膠片感光記錄光信號(hào)。

2 結(jié)果

2．1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 采用姊妹PCR克隆法成功構(gòu)建了pCMV-Myc-ANKIB1(1-480)和pGEX-5X-ANKIB1(1-480)重組載體(圖1)。在構(gòu)建表達(dá)載體的過程中，雜交ANKIB1(1-480)片段與經(jīng)過BglⅡ/NotⅠ雙酶切的pCMV-Myc質(zhì)粒能夠有效連接，但與經(jīng)過BamHⅠ/NotⅠ酶切具有相同黏性末端的pGEX-5X-3連接效率很低，推測不同質(zhì)粒載體的二級或高級結(jié)構(gòu)對連接反應(yīng)有較大影響。

2．2 抗原的表達(dá)與純化 經(jīng)過誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，當(dāng)培養(yǎng)溫度降至20℃，重組E．coli在含有0．1 mmol/L IPTG的2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5小時(shí)，可溶性蛋白組分中出現(xiàn)一條穩(wěn)定的蛋白條帶，其分子量與GST-ANKIB1(1-480)重組蛋白的理論值(80．2 kD)相符(圖2A)，同時(shí)菌體中還有少量包涵體存在。相比之下，0．05 mmol/L IPTG只能誘導(dǎo)表達(dá)很低水平的可溶性GST-ANKIB1(1-480)蛋白。經(jīng)過Glutathione-sepharose 4B一步親和層析，獲得了很好的純化效果(圖2B)。

2．3 雜交瘤細(xì)胞的篩選 初次ELISA篩選得到了2孔抗GST-ANKIB1(1-480)陽性、抗GST陰性和5孔抗GST-ANKIB1(1-480)及抗GST雙陽性的雜交瘤克隆，經(jīng)過連續(xù)3次克隆化，從抗GST-ANKIB1(1-480)陽性、抗GST陰性的孔中篩選出1株能夠穩(wěn)定分泌ANKIB1抗體的雜交瘤克隆株，命名為7A9。隨機(jī)取5孔克隆化7A9細(xì)胞的培養(yǎng)上清，間接ELISA全部表現(xiàn)為抗GST-ANKIB1(1-480)陽性、抗GST陰性(表1)。Western blot得到了和ELISA一致的結(jié)果，7A9抗體能夠特異性識(shí)別GST-ANKIB1(1-480)和 Myc-ANKIB1(1-480)(圖 3)，表明 7A9能夠分泌ANKIB1特異性抗體。使用兔抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 和 IgM 單克隆抗體分別對7A9抗體的亞類進(jìn)行了鑒定，ELISA結(jié)果顯示該抗體屬于IgG1。

圖1 ANKIB1(1-480)表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig．1 Digestion of ANKIB1(1-480)expression vectors

圖2 SDS-PAGE檢測可溶性GST-ANKIB1(1-480)Fig．2 SDS-PAGE analysis of soluble GST-ANKIB1(1-480)

表1 間接ELISA檢測7A9抗體特異性Tab．1 Specificity of 7A9 McAb detected by indirect ELISA

圖3 Western blot檢測7A9抗體的特異性Fig．3 Western blot analysis of the 7A9 McAb specificity

圖4 Western blot檢測內(nèi)源性和過表達(dá)ANKIB1Fig．4 Detection ofendogenousand overexpressed ANKIB1 by Western blot

圖5 Western blot檢測免疫沉淀的ANKIB1Fig．5 Western blot analysis of immunoprecipitated ANKIB1

2．4 ANKIB1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá) 我們使用純化的7A9抗體檢測了人、大鼠和小鼠腦細(xì)胞以及HEK293ET細(xì)胞中ANKIB1蛋白的表達(dá)情況，Western blot結(jié)果顯示，所有細(xì)胞中均存在至少兩種分子量的ANKIB1蛋白，其中大蛋白的分子量與Q9P2G1的理論分子量相符(121．9 kD)，最小蛋白的分子量約為88 kD，人胎腦中還有一條特異的約110 kD的蛋白帶(圖4B)，兩種小蛋白可能是ANKIB1轉(zhuǎn)錄本選擇性剪接并翻譯的產(chǎn)物。3種蛋白在人、大鼠和小鼠腦細(xì)胞中的表達(dá)存在明顯差異，可能是種屬不同所致，也可能與三種組織細(xì)胞的發(fā)育程度不完全一致有關(guān)。令人意外的是，在HEK293ET細(xì)胞中過表達(dá)的Myc-ANKIB1重組蛋白分子量接近150 kD(圖4A)，與其理論分子量(125.1 kD)相差很大。

2．5 ANKIB1單抗在免疫沉淀中的應(yīng)用 為了確定7A9單抗的應(yīng)用范圍，我們通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測了其對不同分子量ANKIB1蛋白的免疫沉降作用，結(jié)果顯示7A9單抗對過表達(dá)和121．9 kD的內(nèi)源性ANKIB1蛋白均有很好的免疫沉降作用，對約88 kD的內(nèi)源性ANKIB1蛋白的免疫沉降作用較差(圖5)。

3 討論

為了使用不含外源氨基酸序列的ANKIB1(1-480)蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠，避免在篩選陽性雜交瘤細(xì)胞時(shí)受到GST特異性克隆的干擾，我們曾使用Xa因子消化GST-ANKIB1(1-480)融合蛋白以切除GST。可能是融合蛋白的構(gòu)象掩蓋了Xa因子的識(shí)別位點(diǎn)，多次消化均不能從GST-ANKIB1(1-480)中切除 GST，所以我們直接使用 GSTANKIB1(1-480)融合蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠。在雜交瘤篩選過程中，分別以 GST和 GSTANKIB1(1-480)蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板進(jìn)行間接ELISA檢測，從陽性雜交瘤中剔除了分泌GST抗體的陽性克隆。為了保證ANKIB1抗體的特異性，我們進(jìn)一步通過Western blot進(jìn)行鑒定，包括分別使用GST抗體和7A9抗體檢測GST-ANKIB1(1-480)，另外使用Myc抗體和7A9抗體檢測Myc-ANKIB1(1-480)，7A9抗體的檢測結(jié)果與GST以及Myc抗體完全一致，充分說明7A9抗體是ANKIB1特異性抗體。經(jīng)鑒定，7A9抗體株所分泌單抗為IgG1。實(shí)驗(yàn)證明我們所制備的ANKIB1單克隆抗體還可以應(yīng)用于免疫沉淀，同時(shí)，由于人源ANKIB1(1-480)與小鼠和大鼠ANKIB1(1-481)的同源性分別高達(dá)96．9%和97.1%，7A9抗體還能夠有效識(shí)別小鼠和大鼠的ANKIB1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)還將確定抗體是否可以應(yīng)用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，以拓寬該抗體的應(yīng)用范圍，并確定ANKIB1基因的時(shí)空表達(dá)譜。

利用7A9單克隆抗體，我們初步確定了ANKIB1在人胚胎、大鼠和小鼠腦細(xì)胞以及HEK293ET培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)，不同細(xì)胞中均存在兩種以上不同分子量的ANKIB1蛋白，其中人體細(xì)胞以121．9 kD的蛋白為主。88 kD的ANKIB1蛋白在人體細(xì)胞中表達(dá)十分穩(wěn)定，在小鼠和大鼠腦組織中甚至是主要的表達(dá)形式，因此可以確定該蛋白是一種正常表達(dá)的蛋白，而不會(huì)是121．9 kD蛋白的降解產(chǎn)物。110 kD的蛋白可能同88 kD的蛋白一樣，分別由ANKIB1 hnRNA的不同剪接體編碼。但目前確定的含有典型Kozak序列的人源ANKIB1 mRNA僅有NM_019004一種，編碼1089 aa的ANKIB1蛋白。確定110 kD和88 kD蛋白的mRNA編碼序列，還需要新的研究支持。在不同細(xì)胞中，我們還檢測到一條含量很低分子量接近150 kD的蛋白，在HEK293ET細(xì)胞中進(jìn)行ANKIB1的過表達(dá)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)帶有Myc標(biāo)簽的ANKIB1重組蛋白分子量明顯超過理論值，與內(nèi)源性150 kD的蛋白十分接近，Miller等［7］在 HEK293T細(xì)胞中過表達(dá) HA-ANKIB1時(shí)也出現(xiàn)了重組蛋白分子量顯著大于理論值的現(xiàn)象。因此我們推測，150 kD的蛋白是經(jīng)過翻譯后修飾的ANKIB1，在正常細(xì)胞中含量很低，當(dāng)ANKIB1的N端融合Myc和HA等標(biāo)簽后，蛋白的構(gòu)象受到標(biāo)簽的影響發(fā)生變化，暴露出可修飾位點(diǎn)，使重組蛋白全部被修飾。如果此推測成立，將表明ANKIB1的N端對維持其構(gòu)象具有重要的意義，也提示150 kD的蛋白可能是ANKIB1的一種主要修飾形式。

1 Li J，Mahajan A，Tsai M D．Ankyrin repeat:a unique motif mediating protein-protein interactions［J］．Biochemistry，2006;45(51):15168-15178．

2 Al-Khodor S，Price C T，Kalia A et al．Functional diversity of ankyrin repeats in microbial proteins［J］．Trends Microbiol，2010;18(3):132-139．

3 Zhao J，Wei J，Mialki R K et al．F-box protein FBXL19-mediated ubiquitination and degradation of the receptor for IL-33 limits pulmonary inflammation［J］．Nat Immunol，2012;13(7):651-658．

4 Budhidarmo R，Nakatani Y，Day C L．RINGs hold the key to ubiquitin transfer［J］．Trends Biochem Sci，2012;37(2):58-65．

5 Marín I．RBR ubiquitin ligases:Diversification and streamlining in animal lineages［J］．J Mol Evol，2009;69(1):54-64．

6 Song A X，Zhou C J，Peng Y et al．Structural transformation of the tandem ubiquitin-interacting motifs in ataxin-3 and their cooperative interactionswith ubiquitin chains ［J］．PLoS One，2010;5(10):e13202．

7 Miller S L，Malotky E，O＇Bryan J P．Analysis of the role of ubiquitininteracting motifs in ubiquitin binding and ubiquitylation ［J］．J Biol Chem，2004;279(32):33528-33537．

8 Uchiki T，Kim H T，Zhai B et al．The ubiquitin-interacting motif protein，S5a，is ubiquitinated by all types of ubiquitin ligases by a mechanism different from typical substrate［J］．J Biol Chem，2009;284(19):12622-12632．

9 Muscarella L A，Guarnieri V，Coco M et al．Small deletion at the 7q21．2 locus in a CCM family detected by real-time quantitative PCR［J］．J Biomed Biotechnol，2010;2010:854737．

10 Xie B H，Xie Y F．Twin PCRs:a simple and efficient method for directional cloning of PCR products［J］．World J Microb Biot，2011;27(9):2223-2225．

11G．C．霍華德，M．R．凱瑟．抗體制備與使用實(shí)驗(yàn)指南［M］．北京:科學(xué)出版社，2010:60-66．