張 萃 盧文菊 李紅枝 黃超賢 王華妹 丘世龍 梅儷凡

(廣東藥學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，廣州510006)

瞬時受體電位陽離子通道蛋白6(Transient receptor potential channel，TRPC6)是瞬時受體電位陽離子通道(TRPC)一個亞群，Winn等2005年首次報道TRPC6通道位于腎小球足細(xì)胞，是裂隙膜的重要組成部分，編碼足細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白，其表達(dá)量的改變可導(dǎo)致大量蛋白尿，從而引起局灶節(jié)段性腎小球硬化和進(jìn)行性腎衰竭［1］。隨著研究的深入，在機體多個系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)有TRPC6通道的存在，并與多種疾病關(guān)系密切，近年來成為研究熱點［2，3］。測定 TRPC6的表達(dá)多在核酸水平上檢測和免疫印跡法測定蛋白表達(dá)，所應(yīng)用的多以TRPC6的多克隆抗體為主。基于單克隆抗體的諸多優(yōu)勢，本文在制備抗TRPC6多肽的單克隆抗體基礎(chǔ)上，結(jié)合生物信息學(xué)分析單克隆抗體的表位識別特性，為進(jìn)一步的TRPC6基礎(chǔ)研究和臨床檢測提供新途徑。

1 材料與方法

1．1 動物和細(xì)胞株 SPF級6周齡BALB/c小鼠，雌性，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，批號為SCXK(粵)2008-0002，飼養(yǎng)2周適應(yīng)環(huán)境后用于免疫;P3-X63-Ag8．653小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，由本室劉曉波教授贈送，購自ATCC，本室保存。

1．2 主要試劑 優(yōu)級胎牛血清，購自天津市灝洋生物制品科技公司;RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司;HAT、HT、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購自美國Sigma公司;羊抗小鼠IgG-HRP，購自Earth-Ox公司;PEG4000，購自美國Sigma公司;96孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、酶標(biāo)板均購自德國CORNING公司;TRPC6多肽合成的各種氨基酸、KLH均由上海強耀生物科技有限公司提供。

1．3 小鼠免疫及抗TRPC6多克隆抗體的檢測 一次免疫3只小鼠，每次取50 μg TRPC6多肽-KLH偶聯(lián)物，采取小鼠皮下多點注射法，間隔3周，第三次免疫1周后采血測其效價，選擇高效價者進(jìn)行加強免疫，加強免疫3天后準(zhǔn)備細(xì)胞融合，小鼠血清保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4 雜交瘤細(xì)胞株的建立 按照傳統(tǒng)單克隆抗體制備技術(shù)進(jìn)行，經(jīng)有限稀釋法克隆化培養(yǎng)獲得雜交瘤細(xì)胞株。并經(jīng)過反復(fù)凍存、復(fù)蘇后，鑒定染色體及單抗分泌穩(wěn)定者建立雜交瘤細(xì)胞株。

1．5 抗TRPC6多肽單克隆抗體的特性鑒定

1．5．1 間接ELISA法檢測抗體效價 以10 μg/ml包被 TRPC6多肽(1 μg/孔)，余下步驟按照間接ELISA法常規(guī)操作。

1．5．2 雜交瘤細(xì)胞株染色體鑒定 采用秋水仙素阻斷法進(jìn)行染色體計數(shù)。

1．5．3 單克隆抗體相對親和力鑒定 包被TRPC6多肽(1 μg/孔)，各株單抗?jié)舛葹?100、50、25、12．5和6．25 μg/ml，37℃孵育1 小時，洗滌3 次后加入酶標(biāo)二抗(1∶5 000)，37℃ 1小時后洗滌，加底物顯色測定，按50%最大結(jié)合的單抗計算其相對親和力。

1．5．4 單克隆抗體腹水制備及亞類鑒定 按常規(guī)方法取8周齡BALB/c小鼠進(jìn)行腹水制備。將單抗腹水以1∶100比例開始倍比稀釋，采用間接ELISA檢測其反應(yīng)效價。同時用HRP標(biāo)記羊抗小鼠抗體亞類鑒定試劑盒對純化腹水中單抗進(jìn)行亞類鑒定。

1．5．5 小鼠腦組織總蛋白的提取及TRPC6的檢測腦蛋白蛋白提取采用試劑盒(購于廣州健侖生物科技有限公司);TRPC6蛋白檢測采用間接ELISA法和雙抗體ELISA夾心法。

1．6 單克隆抗體所識別的抗原表位分析

1．6．1 多肽設(shè)計及表位預(yù)測 應(yīng)用DNAStar軟件對TRPC6蛋白二級結(jié)構(gòu)和表面特性(如親水性、表面性、抗原性)等進(jìn)行預(yù)測。根據(jù)預(yù)測結(jié)果先后設(shè)計一系列連續(xù)或非連續(xù)性短肽序列(見表1)，方法參考文獻(xiàn)［4］。

1．6．2 肽段的抗原性、親水性和線性表位預(yù)測 采用在線IEDB分析工具。

1．6．3 單抗識別抗原的位點分析 采用ELISA單抗相加試驗測定。

1．7 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)通過 SPSS軟件(16．0版本)分析，統(tǒng)計方法為t檢驗，數(shù)據(jù)用x±s表示。

2 結(jié)果

2．1 TRPC6多肽單抗的制備與鑒定

2．1．1 免疫原的制備 經(jīng)過多肽設(shè)計與篩選，獲得P5(KDLTKVTLGDNVKYY)序列，合成多肽，經(jīng) MS分析所合成多肽的相對分子質(zhì)量測定值1 757．03，HPLC分析其純度＞98%。HPLC結(jié)果如表2。用合成肽與血藍(lán)蛋白KLH偶聯(lián)后，作為免疫原備用。

2．1．2 雜交瘤細(xì)胞株的建立 經(jīng)過3次常規(guī)小鼠免疫，一次加強免疫后，進(jìn)行細(xì)胞融合和4次亞克隆，最終獲得3株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的陽性細(xì)胞株，分別命名為A2、H8和F11。經(jīng)過反復(fù)凍存與復(fù)蘇，傳代半年以上分泌單抗穩(wěn)定。

2．1．3 單抗腹水效價測定及其亞類鑒定 常規(guī)制備腹水，以合成肽為抗原，將腹水按1∶100開始做倍比稀釋，ELISA方法測定其效價在1∶6 400以上。利用單抗亞型鑒定試劑盒對所建立的3株單抗進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果顯示3株單抗均為IgG1，輕鏈均為κ鏈。

表1 P1～P5的氨基酸序列、長度和位置Tab．1 Sequence，size and location of peptide in P1-P5

表2 P5的HPLC分析Tab．2 HPLC analysis of sequence 5

2．1．4 雜交瘤細(xì)胞系染色體分析 通過秋水仙素阻斷法進(jìn)行染色體計數(shù)統(tǒng)計分析，3株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目相對穩(wěn)定，由于小鼠骨髓瘤細(xì)胞Ag8.653的染色體數(shù)為49±7，小鼠體細(xì)胞數(shù)為40±7，因而雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)平均為86±7，細(xì)胞中絕大部分染色體為端部著絲點，結(jié)果見圖1。

2．1．5 單抗相對親和力測定分析 以純化后的腹水采用ELISA方法測定已知濃度的3株單抗，按達(dá)到50%最大結(jié)合的單抗?jié)舛确治鱿鄬τH和性，親和力越大，所需抗體濃度越低。結(jié)果3株單抗達(dá)到50%最大結(jié)合濃度:A2 和H8 均為12．5 μg/ml，F(xiàn)11為6 μg/ml，因此，相對親和力 A2和 H8相近，而F11較強。

2．1．6 單抗特異性檢測TRPC6蛋白 通過間接ELISA檢測三株單抗均能與小鼠腦組織蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，共檢測了10個樣本，平均值為(1．020±0．034)μg/ml，與正常小鼠血清對照(0.101 ±0.003)μg/ml相比，P 值 ＜0．05，結(jié)果有顯著性差異，說明單抗具有良好的特異性。

進(jìn)一步采用雙抗體ELISA夾心法檢測小鼠和大鼠腦蛋白，驗證單抗特異性結(jié)合TRPC6蛋白的作用，同樣各自測定10個樣本，小鼠為(0．82±0.02)μg/ml，大鼠為(1．22 ±0．05)μg/ml，結(jié)果表明所制備的單抗具有與TRPC6蛋白特異性結(jié)合的特性。

圖1 3株雜交瘤細(xì)胞染色體鏡下觀察(姬姆薩染色，×1 000)Fig．1 Chromosome image of three screening hybridoma cells(Giemsa，×1 000)

圖2 P1～P5在人類TRPC6蛋白序列上的位置Fig．2 The location of P1-P5 in human TRPC6 protein

2．2 單抗識別抗原表位的初步鑒定

2．2．1 肽段氨基酸分布及特性預(yù)測

2．2．1．1 TRPC6合成肽序列篩選 根據(jù)抗原多肽設(shè)計原則對TRPC6合成多肽序列進(jìn)行篩選，一般選擇15個氨基酸的長度較為容易合成純度高的多肽，還要避開TRPC6分子的胞內(nèi)段。所以要通過IEDB Analysis Recource提供的蛋白質(zhì)抗原表位在線分析工具進(jìn)行預(yù)測，根據(jù)表露性區(qū)域初步篩選出5段TRPC6分子肽段，分別為 P1、P2、P3、P4和 P5(見表1)。同時要求所選肽段在人與小鼠中均為保守序列，人與鼠的同源性為88%(2 563/2 903)，人類TRPC6分子蛋白序列分布比對結(jié)果見圖2。

2．2．1．2 TRPC6合成肽段篩選結(jié)果 在以上序列設(shè)計的基礎(chǔ)上，分別預(yù)測上述5個肽段氨基酸序列的抗原性、親水性及線性表位，初步篩選出P序列5-KDLTKVTLGDNVKYY為本實驗?zāi)康男蛄校龠M(jìn)一步應(yīng)用Parker法對P5的親水性進(jìn)行分析以及利用DNAstar蛋白分析軟件進(jìn)一步分析確認(rèn)P5的以上特性，結(jié)果最終確定P5為合成肽序列，預(yù)測結(jié)果見表3。

2．2．2 單抗識別抗原的位點分析 在以上生物信息學(xué)預(yù)測各種特性基礎(chǔ)上，采用ELISA單抗相加試驗對抗體識別位點的差異進(jìn)行分析，單抗A2與H8、A2與F11的相加指數(shù)分別為51%和60%，大于50%說明可能為識別不同位點;而F11與H8的相加指數(shù)為18%，小于50%，可能為識別的同一位點。為了進(jìn)一步驗證實驗的重復(fù)性，經(jīng)過三次重復(fù)實驗，變異系數(shù)為1．09% ～9．88%，變異系數(shù) ＜10%，說明離散程度不高，且重復(fù)性良好，結(jié)果見表4。

表3 TRPC6合成肽的抗原性、親水性和線性表位預(yù)測Tab．3 The sequence selection，antigenicity，hydrophilicity and epitope prediction of TRPC6 peptide sequence

表4 3株單克隆抗體相加指數(shù)和表位分析Tab．4 Additivity index and epitope analysis of three monoclone antibody

3 討論

抗原表位是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，抗原通過表位與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，從而引發(fā)免疫應(yīng)答。本實驗綜合運用多個生物信息學(xué)軟件對TRPC6蛋白進(jìn)行表位預(yù)測，初步篩選出了符合要求的肽段(P5)作為免疫肽，合成后通過HPLC對多肽進(jìn)行的純度分析顯示，所合成多肽的純度在98%以上，符合免疫動物要求。運用MS對合成多肽進(jìn)行分子質(zhì)量的測定結(jié)果顯示多肽的相對分子質(zhì)量測定值與理論值相符合，以此確保了所合成的多肽與KLH偶聯(lián)后可作為目的抗原進(jìn)行免疫。實驗中所獲得的單抗通過測定抗體親和力結(jié)果，進(jìn)一步驗證了多肽P5與單抗的結(jié)合力，說明生物信息學(xué)軟件對抗原表位預(yù)測的可行性［5］。此外，在對單抗識別位點分析中，若兩株單抗的相加指數(shù)＞50%，說明可能是針對不同識別位點的抗體;若＜50%可能是針對同一識別位點的抗體，由此獲得A2與H8配對較好，為進(jìn)一步ELISA方法學(xué)的建立提供條件。

在單克隆抗體鑒定過程中，親和力和特異性的測定很重要。抗體親和力測定方法很多，之所以選擇ELISA方法測定單抗相對親和力，是因為具有敏感性高、重復(fù)性好和方便快捷等優(yōu)點。此外，對于用于臨床診斷和治療上的單抗，選擇的原則應(yīng)是在保持高度特異性的前提下選用親和力強的單抗［6］。通過以上實驗獲得的3株單抗中F11親和力較強，可用于下一步的免疫標(biāo)記實驗;進(jìn)一步對單抗的特異性測定結(jié)果表明，所制備的單抗均可以與小鼠和大鼠腦蛋白中的TRPC6結(jié)合。因目前尚無標(biāo)準(zhǔn)TRPC6蛋白做對照，而早期研究該蛋白大量分布于神經(jīng)系統(tǒng)中［7］，所以實驗中初步利用小鼠和大鼠的腦蛋白組織進(jìn)行測定驗證，結(jié)果表明3株單抗均具有與天然TRPC6結(jié)合的生物學(xué)特性。通過以上研究，抗TRPC6多肽單克隆抗體的制備與表位分析，將為今后的免疫學(xué)方法構(gòu)建打下良好的實驗基礎(chǔ)。

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3 劉若飛，張 萃．瞬時受體電位陽離子通道6作為疾病治療靶點研究進(jìn)展［J］．國際藥學(xué)研究雜志，2012;39(6):474-477．

4 張 萃，梅儷凡，盧文菊 et al．瞬時受體電位陽離子通道蛋白6合成肽的設(shè)計與合成［J］．廣東藥學(xué)院學(xué)報，2011;27(5):514-517．

5 曹 凱，黃 路，林治華et al．分子模擬用于尤文肉瘤EWS-FLI1蛋白HLA-A2．1限制性CTL表位的篩選［J］．化學(xué)學(xué)報，2010;68(13)1277-1284．

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7 崔龍彪，金曉航，史 娟．中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的TRPC6離子通道［J］．神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2011;27(5):565-570．