馮春梁，柏雨辰，孫 越，杜 朋，王 璐

（遼寧師范大學化學化工學院功能材料化學研究所，遼寧大連 116029）

基于聚鄰苯二胺復合膜電位型免疫傳感器的制備＊

馮春梁，柏雨辰，孫 越，杜 朋，王 璐

（遼寧師范大學化學化工學院功能材料化學研究所，遼寧大連 116029）

首先利用循環(huán)伏安法制備聚鄰苯二胺（POPD）修飾碳糊電極（CPE／POPD），然后在CPE／POPD上電沉積普魯士藍（PB）和納米金（GNPs），制備CPE／POPD／PB－GNPs電極，最后將羊抗小鼠IgG通過金－氨鍵固定在CPE／POPD／PBGNPs上，從而制得一種免疫傳感器（CPE／POPD／PB－GNPs／Ab）.用循環(huán)伏安法和電化學交流阻抗技術(shù)對電極的修飾過程進行表征.利用所制備的免疫傳感器對溶液中的小鼠IgG進行檢測，結(jié)果表明，在2.0×10－5μg／L和1.0×04μg／L 2種濃度下，免疫傳感器均得到了很穩(wěn)定的電位響應信號，響應時間不超過3min.所制備的免疫傳感器具有靈敏度高、響應速度快、檢測范圍寬、成本低廉等突出優(yōu)點.

聚鄰苯二胺；納米金；普魯士藍；抗體

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：CHI660A型電化學工作站（上海辰華儀器公司）；PXJ－1B數(shù)字式離子計（江蘇電分析儀器廠）；PHS－3C精密酸度計（上海雷磁儀器公司）；LIP900超純水系統(tǒng)（韓國Human公司）；KQ400DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；10μL微量移液器（臨海市華威分析儀器有限公司）.

試劑：氯金酸、鐵氰化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（上海國藥集團化學試劑有限公司）；檸檬酸鈉（沈陽新興試劑廠）；固體石蠟（生工生物工程有限公司）；石墨粉（中鋼集團上海新型石墨材料有限公司）；氯化鐵、硫酸（北京化工廠）；過氧化氫、鄰苯二胺（天津市科密歐化學試劑有限公司）；牛血清蛋白（BSA，北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所）；羊抗小鼠IgG、小鼠IgG（北京索萊寶科技有限公司）.實驗所用化學試劑均為分析純，用水均為超純水.

1.2 炭糊電極的制備

將石墨粉與固體石蠟按照4∶1的比例混合均勻，在加熱的狀態(tài)下，將其填充到直徑為9mm的聚四氟乙烯管中，管的一端用銅導線連接，壓實，冷卻，便制備出碳糊電極.

1.3 CPE／POPD／PB－GNPs的制備

將碳糊電極在打印紙上打磨光亮，在0.5mol／L硫酸中電化學活化后，置入40mmol／L鄰苯二胺（OPD）的H2SO4溶液中，于－0.3～1.5V的電位范圍內(nèi)循環(huán)掃描80圈，掃速為100mV／s，制得CPE／POPD修飾電極，取出后用超純水淋洗干凈備用.

將40mL 0.04mol／L FeCl3·6H2O溶液與稍微過量的H2O2混合，得到溶液A，再將40mL 0.04mol／LK3Fe（CN）6溶液與稍微過量的H2O2混合，得到溶液B，然后在攪拌條件下將溶液A緩慢滴加到溶液B中，攪拌3h，得到普魯士藍溶液.在100mL超純水中加入1mL普魯士藍溶液、1mL 1%氯金酸溶液，攪拌加熱至沸騰后，立即加入4mL 1%的檸檬酸鈉溶液，攪拌加熱10min，然后移去熱源，繼續(xù)攪拌1 0min，冷卻至室溫，便得到GNPs與PB混合膠體溶液.

1.4 抗體的固定化與免疫反應檢測

將CPE／POPD浸入GNPs與PB混合膠體溶液中，在1.55V的電位下，電沉積60min，取出修飾電極，淋洗干凈，浸入2μg／L抗體溶液（由0.01mol／L pH值7.2的PBS配制）中，4℃下孵育4h，制得免疫傳感器（CPE／POPD／PB－GNPs／Ab）.

以所制備的免疫傳感器為工作電極，Ag／AgCl電極為參比電極，利用數(shù)字式離子計檢測電極電位隨抗原濃度的變化.先將工作電極和參比電極置入0.02mol／L pH值為6.0的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，攪拌1 0min，待空白電位穩(wěn)定后，加入不同濃度的抗原溶液，每次加入樣品后都要攪拌2min，待電位穩(wěn)定后，記錄電位值.

1.5 電化學表征

采用三電極體系：修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極.CV和EIS表征在5mmol／L［Fe（CN）6］4－／3－＋0.1mol／L KCl＋0.1mol／L pH值7.0PBS溶液中進行.EIS參數(shù)設定為極化電位選擇開路電位，交流微擾振幅5mV，頻率范圍0.1Hz～10kHz，采用傳統(tǒng)的Randles等效電路對電化學體系進行模擬，得到電荷傳遞電阻（Rct）.循環(huán)伏安掃描的電位范圍為－0.2～0.6V，掃速為1 00mV／s.

2 結(jié)果與討論

2.1 循環(huán)伏安法聚合鄰苯二胺

在酸性、堿性及中性溶液中，OPD都能在電極表面電聚合成膜，但在堿性和中性溶液中得到的聚合膜幾乎無電活性［8］.圖1是在含有40mmol／L鄰苯二胺的0.75mol／L硫酸中電聚合OPD過程的循環(huán)伏安曲線.從圖1a）中可以看出，在第1周的掃描中，在1.0V處出現(xiàn)一較大的氧化峰（O3），這是由于單體OPD氧化生成自由基陽離子所致，反向掃描時并沒有出現(xiàn)與O3對應的還原峰，而在－0.1V和0V處出現(xiàn)了2個還原峰R1和R2，說明生成的陽離子自由基非?；顫姡S即引發(fā)聚合反應.進行第二循環(huán)掃描時（見圖1b）），在－0.15V和0.1V處出現(xiàn)了2個氧化峰O1和O2，第1對氧化還原峰O1和R1可能是中間形成的2，3－二氨基吩嗪發(fā)生的氧化還原反應的結(jié)果，第2對氧化還原峰O2和R2應歸屬于最終所生成的梯型POPD的氧化還原反應.比較前2次循環(huán)掃描結(jié)果（圖1a））可發(fā)現(xiàn)，在第二循環(huán)掃描時1.0V處的O3峰值急劇下降，說明在電極表面形成了“鈍化層”，阻止了OPD單體的進一步氧化.由圖1c）可見，從第2次掃描以后，隨著掃描次數(shù)的增加，O3峰電流開始緩慢下降，同時，在－0.1V和0V附近的還原峰R1和R2的峰電流也逐漸下降，但是，在第10～100次掃描之間（見圖1d）），R1和R2的峰電流峰逐漸增大，R2的峰電位逐漸負移，而且R1逐漸減小直至消失.從圖1d）也可以看出，掃描到達第100圈時，峰O3的峰電流并沒有完全降為0，仍有微小的電流，這是因為仍有一部分的單體能夠到達膜表面繼續(xù)進行反應.這樣可使OPD單體隨著掃描的進行而不斷聚合到電極表面，最終形成穩(wěn)定的鄰苯二胺聚合膜.在pH 7.4PBS中分別對不同循環(huán)掃描圈數(shù)下制備的CPE／POPD進行CV表征時，發(fā)現(xiàn)循環(huán)掃描80圈時制備的CPE／POPD導電性最好.

圖1 碳糊電極表面不同電聚合o－PD過程的循環(huán)伏安曲線

2.2 炭糊電極修飾過程的電化學表征

循環(huán)伏安法（CV）和電化學交流阻抗技術(shù)（EIS）是表征修飾電極的有效方法.利用CV和EIS分別對POPD／PB－GNPs，Ab以及Ag修飾電極進行逐層表征，結(jié)果如圖2所示.由圖2a）可見，當碳糊電極被POPD／PB－GNPs修飾后，其氧化還原峰（2）電流明顯增強，說明POPD／PB－GNPs膜具有良好的電子傳輸性能.而固定Ab后氧化還原峰（3）電流顯著減小，當固定化Ab與Ag反應形成AbAg復合物以后，氧化還原峰（4）電流幾乎消失，其原因是Ab和Ag都是蛋白質(zhì)，沒有導電性，幾乎阻斷了電子傳遞.由圖2b）可見，EIS圖譜包括半圓和直線2個部分.高頻區(qū)的半圓直徑代表電子傳遞電阻Rct，低頻區(qū)的直線部分表明電極過程受擴散控制.當碳糊電極（1）被POPD／PB－GNPs（2）修飾后，Rct值由779.6Ω減小到103.2Ω，表明［Fe（CN）6］4－／3－探針離子在POPD／PB－GNPs電子傳遞電阻很小，而固定Ab和Ag后，Rct值又依次增大到1 819Ω和2 388Ω，阻礙了電荷傳輸，EIS與CV表征結(jié)果一致，說明在POPD／PB－GNPs修飾PCE表面可以有效實現(xiàn)Ab固定化，并對Ag具有良好的免疫反應活性.

2.3 免疫反應的檢測

CPE／POPD／PB－GNPs／Ab上的固定化Ab與游離抗原（小鼠IgG，Ag）發(fā)生免疫反應時，由于不同蛋白質(zhì)的等電點不同，因而發(fā)生免疫反應前后電極表面上所帶電荷的極性和密度會發(fā)生相應變化，使電極電位發(fā)生變化.在一定條件下，電位變化的大小與被測抗原濃度之間具有一定比例關系μ，通過測定電位便可達到檢測抗原（或抗體）的目的.利用所制備的免疫傳感器分別對濃度為2.0×10－5μg／L和1.0×104μg／L的小鼠IgG溶液進行檢測，如圖4所示，不論是濃度低至10－5數(shù)量級還是高至104數(shù)量級，均得到了很穩(wěn)定的電位響應信號，而且響應時間在3min以內(nèi).

圖2 碳糊電極修飾過程的CV（a）和EIS（b）表征

圖3 2種濃度下免疫傳感器的時間－電位響應曲線

3 結(jié)語

實驗結(jié)果表明，利用循環(huán)伏安法在碳糊電極上直接聚合鄰苯二胺是一種陽離子引發(fā)聚合過程，進一步在PCE／POPD上電沉積PB－GNPs不僅能夠提高修飾電極的電子傳輸性能，而且可以通過金－氨鍵將蛋白質(zhì)固定于碳糊電極表面，固定后的Ab對游離Ag具有良好的免疫反應活性.以廉價的碳糊電極為基礎電極，利用POPD／PB－GNPs固定抗體所制備的免疫傳感器有方法簡便、價格低廉、響應迅速、靈敏度高、檢測范圍寬等突出優(yōu)點，具有深入研究的價值和廣闊的應用前景.

［1］ ZHU Ye，WEI CHOON ALVIN KOH，SHIM YOON BO.An Amperometric Immunosensor for IgG Based on Conducting Polymer and Carbon Nanotube－Linked Hydrazine Label［J］.Electroanalysis，2010，22（24）：2 908－2 914.

［2］ JUNG YONGWON，JEONGA JIN YOUNG，CHUNG BONG HYUN.Recent Advances in Immobilization Methods of Antibodies on Solid Supports［J］.Analyst，2008，133：697－701.

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（責任編輯 易必武）

Preparation of Potentiornetric Immunosensor Based on Poly（o－Phenylenediamine）Film

FENG Chun－liang，BAI Yu－chen，SUN Yue，DU Peng，WANG Lu
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Institute of Chemistry for Functionalized Materials，Liaoning Normal University，Dalian 116029，China）

Firstly，o－phenylenediamine（OPD）was electropolymerized on carbon paste electrode（CPE／POPD）by cyclic voltammetry method.Then the gold nanoparticals（GNPs）and prussian blue（PB）were deposited onto the CPE／POPD by electrodeposition technology to fabricate CPE／POPD／PB－GNPs electrode.Finally，the goat anti－mouse IgG（antibody，Ab）were immobilizeded on to the CPE／POPD／PBGNPs electrode through Au－NH－bond，and thus a potentiometric immunosensor（CPE／POPD／PB－GNPs／Ab）was sucessfully prepared.The modified process of the electrode was characterized by cyclic voltammetry（CV）and electrochemical impedance spectroscopy（EIS）.The immunosensor exhibited fast potentiometric response（＜3min）under the antigen concentration of 2.0×10－5μg／L and 1.0×104μg／L when it was used to detect the mouse IgG.The results of experiments showed that the immunosensor based on POPD／GNPs－PB composite film exhibited the advantages of high sensitivity，fast response，wide detection range and low cost.

poly（o－phenylenediamine）；nano gold；prussian blue；antibody

O657.1

B

10.3969／j.issn.1007－2985.2013.04.015

1007－2985（2013）04－0067－05

電化學免疫傳感器由基礎電極和固定化抗體（或抗原）構(gòu)成，具有操作簡單、響應速度快、靈敏度高、價格低廉等優(yōu)點，在食品工業(yè)、臨床診斷、軍事醫(yī)學和環(huán)境監(jiān)測等領域有廣泛的應用前景［1］.但是，在免疫傳感器的研究與應用中仍存在亟待解決的諸多問題，如抗體（或抗原）的有效固定并且能保持其生物活性，降低甚至消除抗原（或抗體）的非特異性吸附，提高傳感器的再生性能等.將抗體穩(wěn)定地、高活性地固定于基底電極表面，是制備免疫傳感器的關鍵技術(shù)之一［2］.一些芳香聚合物具有良好的導電性，已成為一類固定蛋白質(zhì)分子的良好載體.目前，用于固定蛋白質(zhì)分子的導電聚合物主要有聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩、聚鄰苯二胺（POPD）等［3］.由于POPD比聚苯胺具有更多的氨基及亞氨基，因而能夠提供更多的再修飾基團.POPD還有良好的導電性、電化學活性，在空氣和水溶液中有很高的穩(wěn)定性，是構(gòu)建電化學免疫傳感器的一種理想的功能材料［4］.近年來，納米材料在生物傳感器中的應用已受到人們的廣泛關注.納米金粒子（GNPs）具有高比表面積、強吸附力及良好的生物相容性等優(yōu)異特性［5］，GNPs即可通過金－氨鍵與POPD修飾電極表面上的氨基結(jié)合，又可以與蛋白質(zhì)分子的氨基結(jié)合，使蛋白質(zhì)分子牢固的固定在基底電極上.普魯士藍（PB）具有良好的化學穩(wěn)定性、電催化特性，且制備簡單、成本低廉，在生物傳感器領域被廣泛用作電子媒介體［6］.

基底電極的選擇是設計構(gòu)建電化學生物傳感器的重要內(nèi)容.常用的基底電極一般都是一些惰性電極，如金、鉑、玻碳電極等，但碳糊電極（CPE）應用得較少，而碳糊電極無毒、電位窗口寬、制作簡單、成本低廉、表面容易更新，以碳糊電極為基底電極的電化學生物傳感器具有更多的實用價值［7］.

2013－04－02

國家自然科學基金資助項目（60572009）；遼寧省教育廳高校重點實驗室項目（2008S134）

馮春梁（1956－），男，遼寧岫巖人，遼寧師范大學化學化工學院教授，主要從事電化學、生物傳感器、酶催化動力學研究.