平喘巴布劑藥材的提取工藝研究

蘭小群 葉秀波 黃雨威 王利勝

1.廣東嶺南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510663；2.廣東省廣州市海珠區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州 510220；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006

平喘巴布劑源于《張氏醫(yī)通》，是由芥子、延胡索、甘遂、細(xì)辛等幾味藥材組成，具有利氣祛痰散寒逐飲之效，多用于穴位敷貼防治哮喘，屬于經(jīng)皮給藥系統(tǒng)，療效確切，且在臨床上具有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)[1-2]。在經(jīng)皮給藥制劑中，確保足夠量的藥物透過皮膚進入體內(nèi)達到有效的血藥濃度是關(guān)鍵，方中芥子、延胡索、甘遂、細(xì)辛的主要活性成分均適合于乙醇提取[3-6]，而芥子又為方中君藥，主要含季銨鹽生物堿芥子堿類成分，廣泛存在于十字花科植物中，代表性分是芥子堿，多以硫氰酸鹽形式存在，芥子堿硫氰酸鹽（Sinapine thiocyanate，ST）具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗氧化、抗衰老、抗雄激素、降血壓等多種生物活性[3-7]。因此本研究采用正交試驗法，以芥子堿硫氰酸鹽的提取率為指標(biāo)，優(yōu)選藥材乙醇提取工藝，確定最佳提取條件，為平喘巴布劑體內(nèi)外透皮吸收特性的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 藥品與試劑

芥子堿硫氰酸鹽對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111702-201002）；芥子、延胡索、甘遂、細(xì)辛等（廣州致信中藥飲片有限公司）；磷酸二氫鉀、乙醇為分析純；甲醇、乙腈為色譜純；水為怡寶水。

1.2 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海青浦滬西儀器廠）；KQ-500型超聲清洗儀 （昆山市超聲儀器有限公司）；AUW120D精密分析天平（日本島津公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：迪馬 Platisil ODS 柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），以Phenomenex為保護柱；流動相：乙腈-0.1 mol/L 的磷酸二氫鉀=14∶86；檢測波長：326 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：10 μL。 理論塔板數(shù)按芥子堿硫氰酸鹽峰計算不低于3000。

2.1.2 溶液的配制

2.1.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的芥子堿硫氰酸鹽對照品5.67 mg，于100 mL的容量瓶中，用流動相溶解制成56.7 μg/mL的對照品溶液。

2.1.2.2 對照藥材溶液的制備 精密稱取芥子對照藥材細(xì)粉1.12 g，置具塞的錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲（功率 250 W，頻率 20 KHz）提取 3次，每次20 min，濾過，濾液減壓回收溶劑至干，殘渣用流動相溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中，定容，再用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.3 供試品溶液的制備 按照處方比例稱取芥子、延胡索、細(xì)辛和甘遂，9份，分別按L9（34）正交試驗表進行實驗，每次提取后趁熱過濾，藥液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至藥材量1∶1的濃縮液，放至室溫后，加水定量至20 mL。然后精密吸取1～9號提取液各0.2 mL，置10 mL的容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，再用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得1～9號正交試驗的供試品溶液。

2.1.2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例稱取除芥子外的其他藥材，與供試品溶液同法制備。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 線性范圍考察 分別精密吸取上述芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液 2、6、10、15、20 μL 進樣， 測定，以芥子堿硫氰酸鹽峰面積積分值為縱坐標(biāo)，以進樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=3×106X-29 592，r=0.9999。 結(jié)果表明芥子堿硫氰酸鹽進樣量在0.1134～1.1340 μg范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3.2 精密度試驗 精密吸取芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，測定，按芥子堿硫氰酸鹽的峰面積積分值計算RSD為0.58%，表明該儀器具有良好的精密度。

2.1.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取正交試驗5號供試品溶液 10 μL，分別于 0、2、4、8、12 h 進樣，測定芥子堿硫氰酸鹽峰面積，計算其RSD為1.08%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3.4 重復(fù)性試驗 取正交試驗5號濃縮液，加水定容至 20 mL，再精密吸取 0.2 mL，5 份，按“2.1.2”項下供試品溶液制備方法，制備樣品，分別進樣10 μL，測定，計算芥子堿硫氰酸鹽含量平均值為0.536%，RSD為1.06%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.1.3.5 加樣回收率試驗 精密吸取正交試驗3號提取液0.2 mL，6份，分別加入芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液0.1、0.2和 0.4 mL，置 10 mL的容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，再用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液為加樣回收供試液，分別進樣測定，計算回收率分別為 99.35%（RSD=2.73%），101.66%（RSD=2.13%），99.76%（RSD=1.86%）。 結(jié)果表明，該分析方法的回收率符合要求。

2.1.4 樣品分析

分別精密吸取“2.1.2”項下的芥子對照藥材溶液、陰性樣品溶液、供試品溶液各10 μL，在上述色譜條件下，進樣，分別平行測定兩份，將平均芥子堿硫氰酸鹽峰面積積分值代入線性方程，求各樣品芥子堿硫氰酸鹽的含量，計算芥子對照藥材、1～9號正交試驗樣品中芥子堿硫氰酸鹽提取率。

2.2 正交試驗設(shè)計

根據(jù)各藥材的性質(zhì)，選用乙醇為提取溶媒，對該處方有效成分提取率有較大影響的四個因素：提取時間（A）、乙醇用量（B）、乙醇濃度（C）、提取次數(shù)（D），分別擬定3個水平，以芥子堿硫氰酸鹽提取率（mg/g）為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交試驗表進行優(yōu)選，因素水平表見表1。

表1 因素與水平表

2.3 結(jié)果

2.3.1 各溶液色譜圖

芥子堿硫氰酸鹽對照品、正交實驗樣品、對照藥材以及陰性對照溶液的高效液相色譜圖見圖1。由圖1可見對照品、樣品及對照藥材中芥子堿硫氰酸鹽的出峰時間基本一致，且峰形良好，無雜峰干擾，陰性對照溶液無干擾，表明所建立的方法具有較好的專屬性，可用于平喘巴布劑提取工藝中芥子堿硫氰酸鹽含量的測定。

2.3.2 芥子藥材的含量測定

取本實驗用藥材1.12 g，3份，按照“2.1.2”項下對照藥材溶液制備方法，制備樣品溶液，精密吸取10 μL進樣，測定，計算芥子堿硫氰酸鹽的含量，換算成芥子中芥子堿硫氰酸鹽的含量為0.73%，略高于《中國藥典》2010年版規(guī)定，所以本批藥材符合規(guī)定。

圖1 芥子堿硫氰酸鹽的高效液相色譜圖

2.3.3 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析表

由表2可知，極差分析各因素對藥材提取率的影響順序為：C＞A＞D＞B，經(jīng)方差分析只有C因素有顯著性影響，故應(yīng)取最好值C2，A因素雖無顯著性，但影響僅次于C因素，也可取最好值A(chǔ)2，D和B根據(jù)極差，可取有利于生產(chǎn)節(jié)約成本的次好水平B1D2，因此最佳工藝為A2B1C2D2，即6倍量70%的乙醇回流提取2次每次2 h。

2.4 優(yōu)化工藝驗證

為了考察上述優(yōu)選出的提取工藝的穩(wěn)定性，稱取處方量各藥材，3份，分別以6倍量70%的乙醇回流提取2次每次2 h，趁熱濾過，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至藥材量1∶1的濃縮液，放至室溫后，精密吸取提取液0.2 mL，置10 mL的容量瓶中，用流動相溶解稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液10 μL進樣，計算芥子堿硫氰酸鹽的含量，結(jié)果芥子堿硫氰酸鹽平均提取率為 8.58 mg/g，RSD為 0.83%，浸膏平均收率為15.86% ，RSD為1.36%。結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定可行，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

曾采用水提醇沉和乙醇回流方法提取對比實驗，結(jié)果表明乙醇回流法提取芥子堿硫氰酸鹽提取率稍高一些，而浸膏收率相對較少，同時藥材的合并提取還應(yīng)該考慮到其他成分的影響，因此采用正交試驗繼續(xù)考察提取時間、乙醇用量、乙醇濃度、提取次數(shù)對提取率的影響，優(yōu)選出了最佳的提取工藝，以保證能夠提取到最大量的有效成分，為后面進行的平喘巴布劑體內(nèi)外透皮吸收特性的研究奠定基礎(chǔ)。

3.2 考察指標(biāo)及測定方法的選擇

芥子堿硫氰酸鹽的HPLC法為《中國藥典》2010年版[8]收載，以控制芥子藥材的質(zhì)量，因此本實驗測定芥子堿硫氰酸鹽的含量為考察指標(biāo)，在一定程度上反映芥子有效成份的濃度，也為進一步的透皮吸收試驗及制劑研究奠定了基礎(chǔ)。芥子堿為季胺類生物堿，因而在弱酸性溶液中穩(wěn)定，在堿性條件易分解為芥子酸和膽堿，故本實驗在弱酸性條件下進行有利于被測成分的分離[9]。芥子堿硫氰酸鹽的測定方法文獻報道采用HPLC法較多，為了獲得較好的峰形和分離效果，在流動相中加入3%醋酸，梯度洗脫[10-11]，或加入0.08 mol/L磷酸二氫鉀[12]，本實驗參考藥典選擇后者，并對流動相比例進行了適當(dāng)調(diào)整，方法學(xué)考察證實本方法精密度高，穩(wěn)定性好，可作為后續(xù)研究的測定方法。

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