孟彥波

(邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北 邢臺 054000)

恩曲他濱(emtricitabine，ETC)是一種合成的5位氟取代胞嘧啶硫雜脫氧核苷類似物，在體內(nèi)被細(xì)胞酶磷酸化為恩曲他濱－5'－三磷酸酯，不僅可與脫氧胞苷－5'－三磷酸酯競爭抑制HIV－1反轉(zhuǎn)錄酶的活性，還能嵌入到新生病毒DNA序列中，導(dǎo)致DNA鏈的終止[1]，臨床主要用于艾滋病和慢性乙型肝炎的治療[2－3]。目前，ETC與DNA作用的研究尚未見文獻(xiàn)報道。本研究中以pH=7.4的三羥甲基胺基甲烷－鹽酸(Tris－HCl)為緩沖溶液，利用紫外分光光度法和熒光光譜法研究其與小牛胸腺DNA(ct－DNA)之間的作用模式和作用機(jī)制，測定了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、猝滅常數(shù)等相關(guān)數(shù)據(jù)，為從分子水平了解DNA與小分子的相互作用機(jī)制提供了有用的信息和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);LS50B型熒光分光光度計(美國PerkinElmer公司);pHS－2C型pH計(上海雷磁儀器廠);501型超級恒溫器(上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠);BP211D型1/10萬電子分析天平(美國Sartorius公司);KQ－100A超聲波清洗器(唐山市超聲儀器有限公司)。恩曲他濱由河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心提供;小牛胸腺DNA購自博勵陽(北京)生物醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展有限公司(Sigma公司產(chǎn)品)，純度以 A260nm/A280nm＞1.8衡量，濃度由260 nm的吸光度確定[ε260nm=6 600 L/(mol·cm)]，為 2.38 ×10－4mol/L，4 ℃保存?zhèn)溆肹4];溴化乙錠(EB)配制成 2.53×10－4mol/L的儲備溶液，避光保存，使用時稀釋成所需濃度;Tris－HCl緩沖溶液(0.05 mol/L，pH=7.4)、NaCl和 NaH2PO4等均為分析純;試驗(yàn)用水均為二次石英亞沸蒸餾水。

1.2 方法

吸收光譜:于10 mL離心管中加入2.0 mL Tris－HCl緩沖溶液、一定量的DNA－EB溶液和ETC溶液并稀釋至刻度，搖勻后掃描一定波長范圍內(nèi)的吸收光譜。

熒光光譜:取所需濃度的DNA－EB體系3 mL于石英比色皿中，滴加ETC溶液，混合均勻2～3 min后，測定其熒光光譜。由于每次加入的溶液量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于原溶液的量，故可忽略其體積效應(yīng)，認(rèn)為原溶液的濃度保持不變。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外吸收光譜

在ct－DNA和EB體系中，加入不同量的ETC溶液的吸收光譜見圖1。ETC對DNA－EB的吸收光譜在285 nm波長處產(chǎn)生了較明顯的增色效應(yīng)，但峰位移動不明顯;此外，在308 nm波長處產(chǎn)生等吸點(diǎn)，初步判斷ETC與DNA之間存在著嵌插作用[5]。

2.2 熒光光譜

固定EB－DNA的濃度不變，加入不同濃度ETC后掃描熒光光譜，見圖2。在595 nm波長處，隨著ETC濃度的增加，EB－DNA的熒光強(qiáng)度逐漸降低，進(jìn)一步說明ETC與DNA發(fā)生了相互作用，使得ETC對EB－DNA的熒光產(chǎn)生了淬滅效應(yīng)。

2.3 熒光淬滅方式的判斷

熒光淬滅機(jī)理可分為靜態(tài)淬滅和動態(tài)淬滅[6]。靜態(tài)淬滅是淬滅劑和熒光物質(zhì)分子在基態(tài)時生成不發(fā)光的配合物，導(dǎo)致熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度降低的過程，此過程可用下式描述:F0/F=1+Kq[C](公式1)。動態(tài)淬滅是淬滅劑和熒光分子的激發(fā)態(tài)分子之間的相互碰撞而導(dǎo)致的熒光淬滅，遵循Stern－volmer方程:F0/F=1+Kqτ0[C]=1+Ksv[C](公式2)。公式 1和 2中 F0和 F分別為不存在和存在淬滅體時熒光體的熒光強(qiáng)度;Kq為雙分子淬滅過程的速率常數(shù);Ksv為Stern－volmer動態(tài)淬滅常數(shù);τ0為淬滅劑不存在時熒光分子的熒光平均壽命，[C]為淬滅劑的濃度，而熒光分子壽命約為10－8s[7]，由圖4中直線的斜率可求得淬滅速率常數(shù) Kq=7.8×1010L/(mol·s)。顯然 DNA對 ETC的淬滅常數(shù)大于藥物小分子與生物大分子之間的最大擴(kuò)散所控制的碰撞淬滅常數(shù) 2.0×1010L/(mol·s)[7]，因此DNA對ETC的熒光淬滅不是由于分子間碰撞而引起動態(tài)淬滅的，而是形成了復(fù)合物引起的靜態(tài)淬滅。

對于靜態(tài)淬滅過程，熒光強(qiáng)度與淬滅劑的關(guān)系可由熒光分子與淬滅劑分子之間的結(jié)合常數(shù)表達(dá)式推導(dǎo)求出[8]。設(shè)生物大分子Q與熒光分子 P有 n個相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)，則應(yīng)該存在:nP+Q?PnQ(公式3)。于是反應(yīng)常數(shù) K應(yīng)為:K=[PnQ]/[P]n[Q](公式 4)。

公式4中，[P]是游離熒光體濃度，[Q]是淬滅劑濃度，[PnQ]是復(fù)合物濃度，熒光強(qiáng)度 F與熒光分子P的濃度成正比，則有:[P0]/[P]=F0/F(公式5)。由公式4和5式可以得到:lg[(F0－ F)/F]=lgK+nlg[Q](公式 6)。

固定熒光分子P的濃度[P0]，改變淬滅劑的濃度[Q]，根據(jù)公式6以lg[(F0－F)/F]對lg[Q]作圖可得一直線，由該直線的斜率和截距可求結(jié)合位點(diǎn) n和結(jié)合常數(shù) K。

由圖4所得的直線截距可以計算出ETC與DNA的結(jié)合常數(shù)為 K=1.02×103L/mol，由直線斜率得出結(jié)合位點(diǎn) n=1.03。

2.4 ETC與DNA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力

藥物小分子與生物大分子的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等，不同藥物與生物大分子作用時其作用力類型也可能不同。當(dāng)溫度變化不大時，反應(yīng)的焓變可視作常數(shù)，根據(jù)熱力學(xué)公式可以計算藥物小分子與生物大分子作用的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù):ln(K2/K1)=ΔH(1/T1－1/T2)/R(公式 7)，ΔG=－ RTlnK(公式8)，ΔS=(ΔH－ΔG)/T(公式9)。

根據(jù)藥物小分子與生物大分子作用的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)可以簡單判斷其相互作用類型[9]，若ΔH＞0及ΔS＞0則主要表現(xiàn)為疏水作用;ΔH＜0及ΔS＞0主要表現(xiàn)為靜電作用;ΔH＜0及ΔS＜0主要表現(xiàn)為氫鍵或者范德華力作用。

由圖5可見，隨著溫度的升高，ETC淬滅曲線的斜率隨之降低，由此可判斷該過程是靜態(tài)淬滅而不是動態(tài)淬滅。動態(tài)淬滅是由于分子的擴(kuò)散碰撞導(dǎo)致的，隨著溫度的升高，分子的擴(kuò)散速度會加快，熒光淬滅會更加嚴(yán)重，淬滅常數(shù)應(yīng)更大，這與2.3項(xiàng)下的結(jié)論一致。根據(jù)試驗(yàn)得到不同溫度下的 K值，可以求出ETC與DNA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)為，ΔH=－85.9 kJ/mol，ΔG(300 K)=－17.1 kJ/mol，ΔS(300K)= －0.30 kJ/mol，由此判斷 LMVD 與DNA之間是以氫鍵或者范得華力作用結(jié)合的。

3 討論

采用紫外分光光譜法、熒光光譜法，用EB作為熒光探針研究了ETC與DNA的相互作用。結(jié)果表明，ETC與DNA分子之間的作用模式為嵌插結(jié)合，作用力為氫鍵或范德華力，ETC與DNA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為 1.03，結(jié)合常數(shù)為 1.02 × 103L/mol。

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