劉曉曉 賈鳳蘭 阮 明 張寶旭

北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系 國家中醫(yī)藥管理局中藥配伍減毒重點研究室，北京 100191

1，3-二苯-1，3-丙二酮 （1，3-diphenyl-1，3-proanedione，DPPD），是存在于甘草根中的一種 β-二酮類物質(zhì)[1]，研究發(fā)現(xiàn)其具有化學(xué)防癌[2-4]、抑制DNA及蛋白質(zhì)損傷、抗氧化[5]、抗炎癥等多方面的功效。本實驗室對其多年的研究發(fā)現(xiàn)，DPPD能夠拮抗四氯化碳、可卡因、N-甲基甲酰胺等化學(xué)物質(zhì)造成的肝臟損傷[5-7]。在以往研究的基礎(chǔ)上，本研究對其遺傳毒性進行評價，并探討DPPD對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓細胞微核形成有無預(yù)防保護作用，提供DPPD臨床應(yīng)用的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR雄性小鼠，體重16～18 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2011-0012，使用許可證號：SYXK（京）2011-0039。在恒溫（21～23℃）、恒濕（45%～65%）、12 h明暗周期交替的動物飼養(yǎng)室，實驗前小鼠先適應(yīng)3 d，自由進食和飲水。

1.2 試劑

DPPD（批號：S26175 005），購自 MERCK-Schuchardt，用1%（V/V）吐溫-80水溶液配置成混懸液；環(huán)磷酰胺（批號：09121721），江蘇恒瑞醫(yī)院股份有限公司，用生理鹽水溶解；甲醇（分析純，批號：20100607），北京益利精細化學(xué)品有限公司；小牛血清，上海拜力生物科技有限公司。

1.3 儀器

AR2130/C型電子天平（210 g/0.001 g，美國OHAUS公司）；OLYMPUS 顯微鏡。

1.4 方法

40只小鼠隨機分為8組，分別為陰性對照組，環(huán)磷酰胺陽性對照組，環(huán)磷酰胺+DPPD低、中、高劑量組（62.5、250、1000 mg/kg），DPPD 低、中、高劑量組（62.5、250、1000 mg/kg），每組各5只。環(huán)磷酰胺+DPPD劑量組和DPPD劑量組經(jīng)口給予DPPD 30 d，每天1次，給藥體積0.2 mL/10g。陰性對照組每天給予相同體積的1%（V/V）吐溫-80水溶液。環(huán)磷酰胺采用30 h兩次經(jīng)口給藥法，給藥劑量40 mg/kg，給藥體積0.1 mL/10g，小鼠給藥第29天，環(huán)磷酰胺陽性組和環(huán)磷酰胺+DPPD劑量組經(jīng)口給予環(huán)磷酰胺，間隔24 h后，第2次經(jīng)口給予環(huán)磷酰胺，第2次給藥6 h后，小鼠麻醉后頸椎脫臼處死。立即取股骨制備骨髓涂片，涂片自然干燥后用甲醇固定，經(jīng)Giemsa染色，蒸餾水沖洗、晾干。采用雙盲法閱片，每只小鼠計數(shù)1000個嗜多染紅細胞，觀察含有微核數(shù)的嗜多染紅細胞數(shù)，以千分率表示微核數(shù)，并計算抑制率，抑制率計算方法：抑制率（%）=（致突變物對照組微核率-受試樣品組微核率）/（致突變物對照組微核率-空白對照組微核率）×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用方差分析，比較t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DPPD對骨髓微核形成的影響

與陰性對照組相比，DPPD組小鼠經(jīng)口給予DPPD 30 d，DPPD各劑量組微核率變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），由此可以看出DPPD本身不具有遺傳毒性，見表1。

表1 DPPD對骨髓細胞微核形成的影響

2.2 環(huán)磷酰胺對骨髓細胞微核形成的影響

與陰性對照組相比，環(huán)磷酰胺30 h經(jīng)口給藥后，環(huán)磷酰胺陽性組小鼠微核率明顯升高，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明環(huán)磷酰胺造模成功。見表2。

表2 環(huán)磷酰胺對骨髓細胞微核形成的影響

2.3 DPPD對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓細胞微核的影響

結(jié)果所示，與環(huán)磷酰胺陽性組相比，環(huán)磷酰胺+DPPD低劑組小鼠微核率變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；環(huán)磷酰胺+DPPD中、高劑量組小鼠微核率明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；其微核抑制率分別為35.58%和61.54%。隨著DPPD劑量的升高，微核率逐漸下降，并呈現(xiàn)一定的劑量反應(yīng)關(guān)系。見表3。

表3 DPPD對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓細胞微核形成的影響

3 討論

目前，微核試驗是一種應(yīng)用廣泛的遺傳毒性檢測方法之一，是反映染色體損傷的一種簡易、快速的方法。很多國家和國際組織將微核實驗規(guī)定為評價新藥和食品添加劑等化合物安全性毒理學(xué)評價的必做試驗之一[8]。它主要是通過微核率的變化情況反映化學(xué)物質(zhì)的遺傳毒性，因此微核率是檢測細胞遺傳毒性損傷的一項重要指標。

有文獻報道，長期喂養(yǎng)DPPD（1%飼料含量）未觀察到實驗動物的毒性體征[9]。本實驗室通過DPPD急性經(jīng)口毒性試驗，發(fā)現(xiàn)DPPD小鼠經(jīng)口灌胃的LD50＞17.5 g/kg，可以認為是低毒或無毒物質(zhì)。

本次試驗結(jié)果顯示，通過比較DPPD組和陰性組發(fā)現(xiàn)長期灌胃給予DPPD并未使骨髓細胞微核形成率升高；通過比較環(huán)磷酰胺+DPPD組與環(huán)磷酰胺陽性組發(fā)現(xiàn)DPPD對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓細胞微核形成具有一定的預(yù)防保護作用，能夠明顯抑制環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的骨髓細胞微核形成，且隨著DPPD劑量的增加，抑制作用增強，此結(jié)果提示DPPD不具有遺傳毒性，并且可以拮抗環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)骨髓細胞微核的形成。環(huán)磷酰胺常用于抗腫瘤[10]治療，同時環(huán)磷酰胺具有免疫抑制作用，并用于自身免疫性疾病的治療[11-14]，其療效顯著，應(yīng)用廣泛。但是環(huán)磷酰胺常常引起骨髓抑制不良反應(yīng)，使其應(yīng)用受限。而DPPD本身可以應(yīng)用于化學(xué)防癌[2-4]，如果將DPPD與環(huán)磷酰胺聯(lián)合使用，不但可以拮抗環(huán)磷酰胺的毒副作用，而且可以提高其抗癌療效。因此，本研究將在此基礎(chǔ)上進一步研究DPPD作用機制，并研究與其他藥物聯(lián)合使用的效果，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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