梯度洗脫高效液相色譜法測定辛伐他汀分散片的含量和有關(guān)物質(zhì)

付莉娜 ，鄭金琪 ，鄭國鋼 ，陶巧鳳 ，

(1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014;2.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310004)

辛伐他汀為羥甲基戊二酰輔酶A(HMG－CoA)還原酶抑制劑[1]，可阻斷膽固醇的生物合成[2]，對(duì)高膽固醇血癥、混合型高脂血癥、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病和腦中風(fēng)的防治等有明顯的療效[3－4]，是一種高效的調(diào)血脂藥。辛伐他汀分散片可在水中迅速崩解成均勻的混懸液，具有服用方便、吸收快、生物利用度高等特性[5]。但辛伐他汀分子結(jié)構(gòu)中含有不穩(wěn)定基團(tuán)4－羥基－2H－6氧合－吡喃環(huán)，容易被氧化[6]，在生產(chǎn)和貯藏過程中亦可能產(chǎn)生降解物，因而一般在制劑處方中加入抗氧化劑(常用的是叔丁基－4－羥基－茴香醚和抗壞血酸)，以增加辛伐他汀的穩(wěn)定性。經(jīng)查閱，其國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中未進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查[7]。筆者參考文獻(xiàn)[8]和2010年版《中國藥典(二部)》[9]辛伐他汀片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)方法學(xué)研究，建立了測定辛伐他汀分散片含量和有關(guān)物質(zhì)的梯度洗脫高效液相色譜(HPLC)法。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀(2695泵，2996二極管陣列紫外檢測器);Empower色譜工作站;Mettler AE 240型電子天平。洛伐他汀對(duì)照品(批號(hào)為100600－200301)和辛伐他汀對(duì)照品(批號(hào)為100601－200502)由中國食品藥品檢定研究院提供;辛伐他汀銨(分析純，浙江江北藥業(yè)有限公司);辛伐他汀分散片(規(guī)格為每片10mg，批號(hào)為3134825;規(guī)格為每片20mg，批號(hào)為3134839;規(guī)格為每片40mg，批號(hào)為3134830)為廣州南新制藥有限公司產(chǎn)品;乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Supelco C18柱(33mm×4.6mm，3μm);流動(dòng)相:A 為乙腈－0.1%磷酸溶液(50∶50)，B為含0.1%磷酸乙腈溶液，梯度洗脫程序見表1;流速:3.0mL/min;檢測波長:238 nm。取辛伐他汀對(duì)照品約20mg，置50mL容量瓶中，加0.2mol/L氫氧化鈉溶液－乙腈(1∶1)的混合溶液5.0mL，振搖使溶解，放置5min，加稀鹽酸中和后用2.2項(xiàng)下溶劑稀釋至刻度，得含開環(huán)降解物辛伐他汀酸的溶液，取5.0mL以及洛伐他汀與辛伐他汀對(duì)照品各約2mg，置同一100mL容量瓶中，加2.2項(xiàng)下溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液。取10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果辛伐他汀酸峰與洛伐他汀峰的分離度應(yīng)大于4.0，理論板數(shù)按辛伐他汀峰計(jì)算不低于2 000。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

有關(guān)物質(zhì):取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于辛伐他汀80mg)，精密稱定，置100mL容量瓶中，加溶劑[0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0)－乙腈(40∶60)]溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液;精密量取1.0mL，置100mL容量瓶中，加上述溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

含量測定:稱取辛伐他汀對(duì)照品約10mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加上述溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液;取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于辛伐他汀10 mg)，精密稱定，置100mL容量瓶中，加上述溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 有關(guān)物質(zhì)

專屬性試驗(yàn):取依處方比例混合的輔料適量，依2.2有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下方法制備成輔料溶液，分別取2.2項(xiàng)下溶劑、輔料溶液、系統(tǒng)適用性溶液各10μL進(jìn)樣。結(jié)果見圖1?？梢?，溶劑對(duì)測定無干擾，輔料出峰時(shí)間在0.6min以內(nèi)，在相對(duì)主峰保留時(shí)間的0.3倍內(nèi);辛伐他汀酸、洛伐他汀和辛伐他汀的出峰時(shí)間分別為1.256，1.473，2.135min，辛伐他汀酸峰與洛伐他汀峰之間的分離度為1.6，洛伐他汀峰與辛伐他汀峰之間的分離度大于5.0。

圖1 高效液相色譜圖

強(qiáng)制破壞試驗(yàn):取批號(hào)為3134830的樣品粉末5份，每份約含辛伐他汀40mg，分別置50mL量瓶中，加2.2項(xiàng)下溶劑10mL，振搖使辛伐他汀溶解。分別加入1.0mol/L鹽酸溶液5.0mL，放置24 h，加 1.0 mol/L 氫氧化鈉溶液 5.0mL 中和后，加 2.2項(xiàng)下溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為酸破壞供試品溶液;加入 1.0mol/L 氫氧化鈉溶液 5.0mL，放置 24 h，加 1.0mol/L 鹽酸溶液5.0 mL中和后，加2.2項(xiàng)下溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為堿破壞供試品溶液;加入10%過氧化氫溶液5.0mL，放置 24 h，加 2.2 項(xiàng)下溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為氧化破壞供試品溶液;在(4 500±500)lx光照強(qiáng)度下放置24 h，加2.2項(xiàng)下溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為光照破壞供試品溶液;在60℃水浴中加熱6 h，放冷，加2.2項(xiàng)下溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為熱破壞供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2。可見，辛伐他汀主峰與強(qiáng)制破壞降解產(chǎn)物均能獲得很好的分離。

圖2 強(qiáng)制破壞試驗(yàn)高效液相色譜圖

相對(duì)響應(yīng)因子測定:洛伐他汀是合成辛伐他汀的起始物料，辛伐他汀酸是辛伐他汀的降解產(chǎn)物。辛伐他汀酸極不穩(wěn)定物質(zhì)，故使用其穩(wěn)定的銨鹽辛伐他汀銨進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果洛伐他汀與辛伐他汀的相對(duì)響應(yīng)因子為1.02，辛伐他汀酸與辛伐他汀的相對(duì)響應(yīng)因子為 0.92。

檢測限測定:取含辛伐他汀、洛伐他汀與辛伐他汀酸的對(duì)照品溶液，逐步稀釋，測得辛伐他汀、洛伐他汀與辛伐他汀酸的檢測限分別為 25.14 ng/mL(S/N≈4.6)，20.04 ng/mL(S/N≈2.7)和 27.16 ng/mL(S/N≈3.9)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取批號(hào)為3134825的供試品溶液，分別于0，1，3，6，12 h時(shí)進(jìn)樣，測定有關(guān)物質(zhì)。結(jié)果見表2?？梢?，供試品溶液在12 h內(nèi)有關(guān)物質(zhì)有所增加，但在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定，故建議在供試品溶液制備3 h內(nèi)測定。

表2 有關(guān)物質(zhì)測定溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 含量測定

線性關(guān)系考察:取辛伐他汀對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加2.2項(xiàng)下溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液;精密量取 0.2，0.5，0.8，1.0，1.2，1.5，1.8mL，分別置10mL容量瓶中，用2.2項(xiàng)下溶劑稀釋至刻度，搖勻，取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度 C(μg/mL)對(duì)峰面積A作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為 A=12 493C+2 199，r=0.999 9(n=7)。結(jié)果表明，辛伐他汀質(zhì)量濃度在 20.02～180.2 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn):取批號(hào)為3134825的樣品，于同一日內(nèi)及不同日內(nèi)依法分別連續(xù)測定含量6次，得日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果辛伐他汀的含量為 93.5% 和 93.8% ，RSD 為 0.59% 和 0.69%(n=6)，表明方法精密度良好。

回收率試驗(yàn):取處方量輔料，另取辛伐他汀對(duì)照品適量，按2.2項(xiàng)下方法分別制備成高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的溶液(120%，100%，80%)各3份，分別取上述溶液各10μL，注入液相色譜儀，以外標(biāo)法測定含量并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.9% ，RSD 為 0.51%(n=9)。

2.4 樣品測定

有關(guān)物質(zhì):取樣品3批，按2.2項(xiàng)下方法分別制備成供試品溶液和對(duì)照溶液。精密量取對(duì)照溶液10μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%;再精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液各10μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，扣除相對(duì)主峰保留時(shí)間0.3倍內(nèi)的輔料峰，單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液的主峰面積(1.0%)，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的3倍(3.0%)，供試品溶液中任何小于對(duì)照溶液主峰面積0.05倍的峰可忽略不計(jì)。結(jié)果見表3。

含量測定:取樣品3批，按2.2項(xiàng)下方法分別制備成對(duì)照品溶液和供試品溶液。精密量取10μL注入液相色譜儀，按外標(biāo)對(duì)照品法測定含量。結(jié)果見表3。

3 討論

辛伐他汀含六元內(nèi)酯環(huán)等不穩(wěn)定基團(tuán)，易被氧化和水解，在生產(chǎn)和貯藏過程中亦可能產(chǎn)生降解產(chǎn)物，而現(xiàn)行國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中未進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查。本試驗(yàn)中參考2010年版《中國藥典(二部)》辛伐他汀片標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)3批樣品進(jìn)行了有關(guān)物質(zhì)檢查，結(jié)果單個(gè)雜質(zhì) 0.20% ～0.33%，雜質(zhì)總量 0.64% ～0.77%，故有必要對(duì)其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行控制。辛伐他汀是不穩(wěn)定物質(zhì)，對(duì)酸、堿、熱和氧化均不穩(wěn)定，市售辛伐他汀分散片的有效期為2年，考慮到產(chǎn)品在有效期內(nèi)的降解空間，建議限度訂為單個(gè)雜質(zhì)不得過1.0%，雜質(zhì)總量不得過3.0%。

由試驗(yàn)結(jié)果可知，洛伐他汀、辛伐他汀酸與辛伐他汀的相對(duì)響應(yīng)因子在0.90～1.10范圍內(nèi)，為方便試驗(yàn)，采用以洛伐他汀和辛伐他汀酸外標(biāo)定位(系統(tǒng)適用性試驗(yàn))，以辛伐他汀為自身對(duì)照測定有關(guān)物質(zhì)。

廠家在辛伐他汀分散片處方中加入了抗氧化劑以增加穩(wěn)定性，抗氧化劑的保留時(shí)間在相對(duì)主峰保留時(shí)間0.3倍內(nèi);同時(shí)，對(duì)辛伐他汀原料藥亦進(jìn)行了降解試驗(yàn)，結(jié)果在相對(duì)主峰保留時(shí)間0.3倍內(nèi)基本無降解雜質(zhì)峰。因此，擬在有關(guān)物質(zhì)測定時(shí)，扣除相對(duì)主峰保留時(shí)間0.3倍內(nèi)的輔料峰后，測定辛伐他汀分散片的最大單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量。

表3 樣品有關(guān)物質(zhì)及含量測定結(jié)果

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