馮安華，王占聚，刁琳琳，劉永，陳國霞

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院;2.濰坊市臨朐縣五井中心衛(wèi)生院，山東濰坊261042)

PTEN基因定位于染色體10q23.3，是具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，與多種實體瘤的發(fā)生密切相關(guān)。近年來多項研究表明該基因的異常表達與血液系統(tǒng)腫瘤如白血病的發(fā)病、發(fā)展及預(yù)后有重要關(guān)系，本文采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT－PCR)及免疫印跡雜交方法 (Western blot)，主要研究該基因在正常核型AML中的表達及臨床意義。

1 方法與資料

1.1 一般資料

收集濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2011年6月至2012年10月期間住院及門診隨訪的AML患者，從中篩選出表達正常核型 (根據(jù)《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制 (ISCN 1995)》判定)的AML患者共15例 (其中初診病人8例，復(fù)診病人7例)，F(xiàn)AB亞型為M0者1例，M1者1例，M2者5例，M3者1例，M4者2例，M5者4例，M6者1例，男6例，女9例，中位年齡35(7～58)歲。診斷標準:參照《血液病診斷及療效標準》 (2007年，張之南主編)。15例AML病人 (M3首選全反式維甲酸+DA方案)采用DA(柔紅霉素+阿糖胞苷)、HA(高三尖杉酯堿+阿糖胞苷)及IA(去甲氧柔紅霉素+阿糖胞苷)等方案誘導(dǎo)化療。選取15例正常人BM設(shè)立對照組，其中男7例，女8例，中位年齡36(25～52)歲。

1.2 取材

1.2.1 有核細胞RNA的提取 分別于確診后化療前、完全緩解后抽取患者2～5 mL骨髓或外周血置于抗凝管中制成懸液，加入等體積淋巴細胞分離液中離心，吸出單個核細胞 (MNC)，洗滌2次。采用TRIzon RNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計檢測RNA純度，RNA濃度 (ug/mL)=OD260×稀釋倍數(shù)×40。

1.2.2 cDNA的合成 將RNase Free dH2O 9.5μL，5×RT buffer 4 μL，dNTP 2 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，Oligo(dT)201μL，總RNA模板2μL，ReverTra Ace 1μL反應(yīng)體系于30℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min條件下反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)結(jié)束后冰浴5 min，所得cDNA于－20℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計與合成 采用Oligo6.0軟件設(shè)計引物。由北京康為世紀生物科技有限公司合成。

1.2.4 PCR及結(jié)果檢測 于PCR板中加入20μL反應(yīng)體系，包括cDNA 2μL，上下游引物各1μL，dNTP1.5μL，MgCl22μL，5×buffer 2μL，ddH2O 10μL，Taq酶0.5μL。擴增條件:預(yù)變性 (94℃，1 min)、變性 (94℃，1 min)、退火 (58℃，30 s)、延伸 (72℃，1 min)，進行40個循環(huán)，72℃10 min后離心，－20℃保存。將10μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳1 h，紫外燈檢測。

1.2.5 總蛋白提取及蛋白濃度測定 按每107個MNC細胞加1 mL預(yù)冷的Lysis buffer(1 mL Lysis buffer+5μL磷酸酶抑制劑+1μL蛋白酶抑制劑+5μL 100 mmol/LPMSF)，將洗滌細胞加到預(yù)冷離心管中，提取細胞總蛋白。按試劑盒說明 (上海生工生物工程有限公司)于96孔標準板上加樣操作，60℃30 min，測定562 nm光密度 (OD)值，利用標準曲線計算蛋白濃度，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 Western blot檢測 將80μg樣品蛋白質(zhì)與等體積緩沖液混勻，經(jīng)5%濃縮膠和10%SDSPAGE凝膠電泳后，用水浴式電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。經(jīng)5%BSA 37℃封閉1 h，加1:1 000的兔抗人單克隆抗體，4℃孵育過夜。TBS/Tween洗膜5 min×3次，加入HRP標記的羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，TBS/Tween洗膜5 min×3次?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測后分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料用均數(shù)±標準差表示，采用F檢驗和q檢驗進行多組均數(shù)間的比較;計數(shù)資料采用ˉx±s檢驗。

2 結(jié) 果

PTEN mRNA在AML組陽性表達水平低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);初診/復(fù)治AML組mRNA陽性表達水平低于完全緩解AML組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。AML組PTEN蛋白陽性表達水平低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);初診/復(fù)治的AML組PTEN蛋白陽性表達水平低于完全緩解的AML組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。

表1 各組PTEN基因及蛋白表達比較

3 討 論

PTEN是同時具有蛋白磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性的抑癌基因，通過下調(diào)PI3P/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［1］，抑制腫瘤細胞增殖和侵襲;通過降低FAK的酪氨酸磷酸化水平，促進細胞凋亡，抑制細胞的增殖。多種研究發(fā)現(xiàn)，在AML中PTEN基因可能通過堿基突變、缺失、啟動子區(qū)域甲基化等在基因水平上的異常及翻譯過程或者蛋白水平等多種異常機制失活［1－2］。有報道在蛋白水平 NF－kB下調(diào) PTEN表達，而抑制其促凋亡效應(yīng)［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，在排除異常核型干擾的情況下，初發(fā)/復(fù)發(fā)AML患者細胞中存在PTEN基因及蛋白的低表達，在達到完全緩解后，陽性表達率及表達水平均有所提高，且PTEN基因及蛋白的陽性表達無正相關(guān)關(guān)系，說明在正常核型AML中PTEN基因完全缺失少見。另外，在正常核型AML患者BM細胞中，部分PTEN mRNA 的表達可能來自正常細胞［2］1086－1090。

PTEN基因及蛋白的異常表達參與了白血病化療過程中多藥耐藥機制的產(chǎn)生。近年來靶向治療如雷帕霉素［4］等藥物的研究為白血病的治療提供了新的靶點。有學(xué)者認為［5－6］，PTEN表達與否對于區(qū)分正常造血干細胞和白血病干細胞具有重要作用。PTEN基因及蛋白的低表達與預(yù)后不良可能相關(guān)，有待進一步論證。

［1］ Dahia P，Aguiar R，AlbertaJ.PTEN is inversely correlated with the cells urvival fact or Akt/PKB and is inactivated via multiplem echanisms in haematological malignancies［J］ .Oxford:Oxford University Press，1999:185－193．

［2］ 鄒興立，劉霆.抑癌基因pten在骨髓增生異常綜合征及急性髓系白血病的表達［A］.北京:《中國實驗血液學(xué)雜志》編輯部，2008:1086－1090．

［3］ Vasudevan KM，Gurumurthy S，Rangnekar VM.Suppression of PTEN expression by NF－kappaB prevents apoptosis［J］．Poitiers:C.M.B.Association，2004:1007－1021．

［4］ 成志勇，楊曉陽.PTEN對 K562細胞mTOR調(diào)控的研究［A］.上海:《腫瘤》雜志編輯部，2009:139－144．

［5］ Yilmaz OH，Valdez R，TheisenBK，et al．Pten dependence dist inguishes haematopoietic stem cells from leukaemiain itiating cells［J］．London:Nature Publishing Group，2006:475 －482．

［6］ Zhang J，Grindley JC，Y in T，et al．PTEN maintains haematopoietic stem cells and acts in lineage choice and leukaemia prevention［J］．London:Nature Publishing Group，2006:518－522．