張洪亮，姜鑫，張健

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院外科學(xué)教研室;2.濰坊市人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，山東濰坊261042)

關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，無血管、神經(jīng)及淋巴系統(tǒng)，僅靠關(guān)節(jié)液供給大部分營養(yǎng)，因此損傷或缺損后自我修復(fù)能力十分有限，一旦出現(xiàn)上述情況，繼發(fā)的創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)軟骨退變及最終關(guān)節(jié)僵直將導(dǎo)致嚴(yán)重的功能障礙，生活質(zhì)量下降。以往的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)微骨折術(shù)及tPRP對軟骨修復(fù)有一定的效果，但并不是很理想。因此本實(shí)驗(yàn)通過對兩種方法的聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)一步探索軟骨修復(fù)新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑2月齡新西蘭大白兔 (濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)24只，雌雄不限。主要試劑 凝血酶(美Sigma公司)，肝素鈉，3%戊巴比妥鈉。

1.2 方法

1.2.1 tPRP的制備富血小板血漿由實(shí)驗(yàn)大白兔自體制備。自大白兔耳緣靜脈獲得的靜脈血，經(jīng)離心、分離、濃縮獲得富血小板血漿，每1mL富血小板血漿加入1U凝血酶 (Sigma公司)活化;1500r/min離心15min后取上清，即為tPRP。加入肝素鈉500U/mL，避免形成凝膠狀。分裝凍存于－80℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 動(dòng)物模型制作、分組方法選用24只新西蘭大白兔，隨機(jī)分成4組，雌雄不限，3%戊巴比妥鈉 (25mg/kg)耳緣靜脈麻醉，雙膝脫毛后碘伏消毒，暴露膝關(guān)節(jié)，用手搖鉆于雙后肢膝關(guān)節(jié)股骨髁間非負(fù)重區(qū)中央鉆孔，直徑5mm，深約1mm，達(dá)軟骨全層，同時(shí)滴注生理鹽水，防止局部過熱導(dǎo)致周圍軟骨組織壞死。第1組，在軟骨缺損區(qū)用軟骨挫進(jìn)行鑿孔，小孔直徑3～4mm，深度3～4cm，以可見脂肪滴或滲血為度，沖洗關(guān)節(jié)腔清除關(guān)節(jié)腔內(nèi)碎屑。第2組，給予關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射tPRP0.4mL。第3組，應(yīng)用微骨折技術(shù)制備微骨折模型后，充分清洗關(guān)節(jié)腔，給予注射tPRP0.4mL。第4組，空白不給予任何措施修復(fù)，以便組間比較。術(shù)前24h、術(shù)中及術(shù)后48h分別肌肉注射青霉素4萬U/kg預(yù)防感染。4組分別于12w處死取材，行HE、甲苯胺藍(lán)、Masson染色。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 大體觀察主要觀察每組動(dòng)物模型軟骨缺損區(qū)修復(fù)情況，每組修復(fù)區(qū)域修復(fù)軟骨組織的厚度與正常組織邊界區(qū)是否存在階梯狀況，是否存在裂隙，修復(fù)軟骨組織表面的光滑度柔韌性。

1.3.2 組織學(xué)檢查取12w處死動(dòng)物取股骨髁間非負(fù)重區(qū)及周圍1mm組織，并進(jìn)行HE染色，觀察不同組別軟骨缺損中央處修復(fù)后軟骨組織形態(tài)，包括新生軟骨細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量、新生軟骨細(xì)胞周圍基質(zhì)情況、新生軟骨厚度，觀察不同組別修復(fù)缺損區(qū)與正常組織過渡區(qū)的修復(fù)情況。根據(jù)修復(fù)組織的性狀、組織結(jié)構(gòu)特征、周圍軟骨有無退變等特征，參照O'Driscoll，KeeleyandSalter組織形態(tài)學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)對各組動(dòng)物修復(fù)效果X進(jìn)行定量評分。

1.3.3 免疫組化觀察不同組別修復(fù)區(qū)域中心部分Ⅱ型膠原表達(dá)的量 (及染色的深淺程度)，修復(fù)區(qū)域中心部分軟骨細(xì)胞分布情況，修復(fù)區(qū)域與正常組織的過渡情況 (是否存在裂隙)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對各修復(fù)效果Xij參照O'Driscoll，KeeleyandSalter組織形態(tài)學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量評分，采用單因素方差分析及兩兩比較的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察12w后，第1實(shí)驗(yàn)組觀察可見軟骨缺損區(qū)所形成軟骨形態(tài)，已被較致密的白色有光澤的軟骨組織所覆蓋，修復(fù)組織表面不平滑，厚度接近或超出正常邊界軟骨，質(zhì)韌，邊界仍可見。第2實(shí)驗(yàn)組觀察軟骨缺損區(qū)覆蓋完全，色白，較平滑，修復(fù)范圍仍可見。第3實(shí)驗(yàn)組即結(jié)合組缺損區(qū)軟骨修復(fù)組織與正常軟骨很難辨別，厚度、色澤、硬度等與正常軟骨組織接近。第4實(shí)驗(yàn)組軟骨缺損區(qū)灰白色，色澤灰暗，未完全覆蓋，仍殘留正常組織邊界。3個(gè)處理動(dòng)物組都存在一定程度上的修復(fù)，在大體觀察方面沒有顯著差異，但3個(gè)處理實(shí)驗(yàn)組與空白對照組存在顯著差異。

2.2 組織學(xué)檢查本次試驗(yàn)以活體動(dòng)物體內(nèi)處理12w作為終止時(shí)間，將兔膝關(guān)節(jié)股骨髁間非負(fù)重區(qū)軟骨缺損休復(fù)處與周圍1mm范圍正常的軟骨共同取材，分別進(jìn)行HE染色、亞甲基藍(lán)染色、Masson染色。三色染色后可以發(fā)現(xiàn)除第4實(shí)驗(yàn)組外，第1、2、3實(shí)驗(yàn)組新生的軟骨組織與周圍正常軟骨組織結(jié)構(gòu)類似，新生軟骨細(xì)胞與周圍正常軟骨細(xì)胞形態(tài)基本相似，新生軟骨細(xì)胞成簇狀分布，數(shù)量較多且周圍包繞豐富的軟骨基質(zhì) (圖1)。HE染色可發(fā)現(xiàn)第1實(shí)驗(yàn)組新生軟骨細(xì)胞均勻分布在已修復(fù)組織區(qū)內(nèi)，但與正常軟骨組織交界存在一定裂隙;第2實(shí)驗(yàn)組與第1實(shí)驗(yàn)組比較可見新生軟骨組織與正常結(jié)構(gòu)類似，鏡下觀察交界區(qū)模糊，整合良好，未見明顯呈簇狀分布的軟骨細(xì)胞和裂隙;第3實(shí)驗(yàn)組可見軟骨組織修復(fù)區(qū)與正常組織區(qū)無明顯區(qū)別，難分彼此，未見裂隙或交接過渡性組織學(xué)變化 (圖2)。亞甲藍(lán)染色觀察見第1、2、3實(shí)驗(yàn)組新生軟骨細(xì)胞周圍都出現(xiàn)大量軟骨細(xì)胞基質(zhì)，較正常組織染色稍淡。Masson三色法染色可見第1、2、3實(shí)驗(yàn)組新生軟骨細(xì)胞內(nèi)及周圍呈現(xiàn)亮藍(lán)色，表明軟骨基質(zhì)的合成與分泌功能旺盛;第4實(shí)驗(yàn)組染色可見新生組織基本為纖維結(jié)締組織，未見明顯的軟骨組織增生。

2.3 免疫組化軟骨細(xì)胞的分化表型維持的特異性指標(biāo)是Ⅱ型膠原的合成與分泌，若缺乏Ⅱ型膠原的合成與分泌，軟骨細(xì)胞很快會(huì)凋亡。依據(jù)Ⅱ型膠原的這一特性，檢測12 w實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本的Ⅱ型膠原，陽性對照為棕黃色。第1動(dòng)物組 (圖3)、第2動(dòng)物組 (圖4)、第3動(dòng)物組 (圖5)陷窩周圍與新生軟骨細(xì)胞染色尤其明顯，分布呈條索狀，與周圍組織分界明顯。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果參照O'Driscoll，KeeleyandSalter組織形態(tài)學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)出各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物軟骨缺損修復(fù)效果 (Xij)的評分，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組組與對照組共4組數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)每組中每只兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損效果評分Xij，然后進(jìn)行組間比較。根據(jù)單向方差分析的思想，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。表1是各組所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)初步匯總;表2是各組統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算F=30.17，P＜0.05，由此得出3種方式對軟骨缺損的修復(fù)效果是不完全相同的。由表2可得出第3動(dòng)物組修復(fù)效果明顯優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組及對照組;第1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組與第2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，得出兩種方法修復(fù)軟骨組織的效果尚無明顯區(qū)別;同時(shí)第1、2實(shí)驗(yàn)組與第4對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，得出兩種處理方法對軟骨修復(fù)有一定效果。

表1 各實(shí)驗(yàn)組軟骨修復(fù)效果評分統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較

表2 各實(shí)驗(yàn)組之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表

3 討 論

創(chuàng)傷、退變等原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)軟骨缺損是臨床常見的多發(fā)性疾病。由于關(guān)節(jié)軟骨具有自身無血供，多能分化前體細(xì)胞稀少等特點(diǎn)，軟骨幾乎無自我修復(fù)能力，其自發(fā)的修復(fù)過程是形成生物力學(xué)性能較差的纖維軟骨或纖維瘢痕組織。以往的微骨折術(shù)、自體軟骨移植及組織工程等在軟骨修復(fù)方面雖取得一定效果，但仍存在未能理想的解決軟骨力學(xué)性能、強(qiáng)度退化明顯及持久耐用的透明軟骨生成困難等問題［1］。

3.1 修復(fù)與整合的關(guān)系［2］諸多關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)方法，可以從不同程度上減輕患者的癥狀，近年來隨著軟骨修復(fù)技術(shù)的進(jìn)展，軟骨修復(fù)與整合的關(guān)系逐步受到重視。軟骨整合良好能明顯改善關(guān)節(jié)功能，延長修復(fù)組織的壽命，整合不良則可導(dǎo)致關(guān)節(jié)面受力不均而加速軟骨退變。軟骨修復(fù)仰賴于軟骨再生，而軟骨再生是指由新生軟骨替代損傷或缺損軟骨組織的過程，而此過程再通過局部微環(huán)境的應(yīng)力性刺激與組織塑形性逐步恢復(fù)軟骨組織中各組成部分的形態(tài)與功能。影響軟骨修復(fù)質(zhì)量的關(guān)鍵因素為:新生組織與周圍組織的表面整合，新生組織能否承受機(jī)體的正常力學(xué)環(huán)境。關(guān)節(jié)軟骨的良好整合需要兩個(gè)條件:一是新生軟骨與軟骨下骨的整合;二是新生軟骨組織與周圍軟骨組織的整合。整合不良往往導(dǎo)致活動(dòng)的關(guān)節(jié)面受力分布不均衡從而加速軟骨的退變，因此良好的整合既能明顯改善關(guān)節(jié)功能，又能延長修復(fù)軟骨組織的使用壽命，從而提高患者的生活質(zhì)量［3］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微骨折聯(lián)合tPRP修復(fù)缺損軟骨與周圍正常軟骨組織整合效果良好，交界區(qū)未見明顯裂隙，移行性好，退變輕微，修復(fù)軟骨厚度基本滿意。

3.2 微骨折術(shù)在軟骨修復(fù)中的作用關(guān)節(jié)軟骨損傷或缺損后微骨折技術(shù)修復(fù)是臨床骨科及實(shí)驗(yàn)研究的熱門話題之一［4］。Steadman等對233例患者采用微骨折治療，3年隨訪結(jié)果顯示75%患者疼痛改善，11年的臨床隨訪顯示客觀功能指數(shù)顯著提高，7年的主觀評價(jià)有80%患者表示微骨折術(shù)后癥狀緩解［5］。然而術(shù)后組織學(xué)觀察其生物力學(xué)強(qiáng)度較正常軟骨組織差，不能滿足長時(shí)間關(guān)節(jié)軟骨的需要［6］。

3.3 tPRP在軟骨修復(fù)中的作用關(guān)節(jié)內(nèi)注射tPRP、tPRP與支架材料或軟骨細(xì)胞體外復(fù)核后植入軟骨缺損處，能夠有效的修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損和延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［7］。細(xì)胞因子在軟骨修復(fù)整合中的作用至關(guān)重要。富血小板血漿含有血小板源性生長因子 (PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子 (TGF－β)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子 (IGF)成纖維細(xì)胞因子等多種生長因子，PDGF、TGF、IGF及VEGF等已證實(shí)能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞代謝、基質(zhì)合成，是促進(jìn)修復(fù)軟骨整合的細(xì)胞因子［8］。

3.4 聯(lián)合應(yīng)用的意義與展望 實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)單純tPRP修復(fù)軟骨缺損2月后關(guān)節(jié)MRI結(jié)果顯新生軟骨組織未能與正常軟骨組織在形態(tài)上達(dá)到完全一致，而tPRP聯(lián)合軟骨細(xì)胞在軟骨缺損處可形成明顯的軟骨樣組織［9］。臨床所接觸的關(guān)節(jié)軟骨損傷或退變的患者中，軟骨缺損多為較大范圍的剝脫，缺損區(qū)較大直徑一般大于4 cm，且缺損周緣邊界不規(guī)則，單一運(yùn)用微骨折術(shù)修復(fù)區(qū)域與邊界區(qū)域整合效果一般。因此應(yīng)用兩種方式實(shí)現(xiàn)優(yōu)劣勢的互補(bǔ)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)修復(fù)與整合的統(tǒng)一，給軟骨修復(fù)的研究提供新的研究方向及思路。

(此文圖1－5見附頁4－5)

圖1 HE染色微骨折組、tPRP組、聯(lián)合應(yīng)用組可見新生軟骨均能對軟骨缺損區(qū)進(jìn)行修復(fù)，修復(fù)后顯示新生軟骨呈簇狀散布于軟骨陷窩內(nèi) (×400)

圖2 HE染色顯示聯(lián)合應(yīng)用兩種處理方法的實(shí)驗(yàn)組修復(fù)后的軟骨組織與周圍正常組織間移行良好，實(shí)現(xiàn)了比較理想的整合 (×400)

圖3 Masson染色注射tPRP修復(fù)組Ⅱ型膠原表達(dá)較豐富(×400)

圖4 Masson染色單純微骨折術(shù)修復(fù)組Ⅱ型膠原表達(dá)量較tPRP組及復(fù)合組少，染色淡 (×100)

圖5 Masson染色聯(lián)合組與tPRP組及微骨折組比較，顯示Ⅱ型膠原表達(dá)的表達(dá)量明顯多于單一處理方法 (×400)

［1］ Williams RJ 3rd，HamLy HW.Mcro － fracture:indications，technique，and results ［J］．Instr Course Lect，2007，56:419－428．

［2］ 李文輝，侯筱魁，湯亭亭，等．可注射性藻酸鈣凝膠修復(fù)整合兔膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國矯形外科雜志，2005，13(5):372－375．

［3］ DiMicco MA，Sah Rl.Integrative cartilage repair:adhesive strength is correlated with collagen deposition［J］．J Orthop Res，2001，19(6):1105 －1112．

［4］ Takao M，Uchio Y，Kakimaru H，et al．Arthroscopic drilling with debridement o f remaining cartilage for osteochondrallesions of the talardome in unstable ankles［J］．Am J Sports Med，2004，32(2):332－336．

［5］ Steadman JR，Briggs KK，Rodrigo JJ，et al．Outcomes of micro－fracture for traumatic chondral defects of the knee:average 11－year follow up［J］．Arthroscopy，2003，19:477－484．

［6］ Gobbi A，Nunag P，Malinowski K．Treatment of full thickness chondrallesions of the knee with micro－fracture in a group of athletes［J］．Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2005，13:213－221．

［7］ Sanchez M，Anitua E，Azofra J，et al．Intra－artcular injection of an autologous preparation rich in growth factorsfor the treatment of knee OA:a retrospective cohort study［J］．Clin Exp Rheumatol，2008，26(5):910 －913．

［8］ Mishima Y，Lotz M．Chemotaxis of human articular chondrocytes and mesenchymal stem cells ［J］．J Orthop Res，2008，26(10):1407－1412．

［9］ Wu W，Chen F，Liu Y，et al．Autologous injectable tissueengineered cartilage by using platelet－rich plasma;experimental study in a rabbit model［J］．JOral Maxillofac Surg，2007，65(10):1951－1957．