王景晶，張長利，楊 宏

（北京工業(yè)大學(xué)建筑工程學(xué)院，北京 100124）

錳是人體必需的微量元素之一[1,2]，但是過量錳的攝入會(huì)引起人體神經(jīng)系統(tǒng)的病變。我國《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 5749—2006）規(guī)定錳的含量最高為0.1 mg／L。世界衛(wèi)生組織和歐盟對生活飲用水中錳含量的理想標(biāo)準(zhǔn)值規(guī)定為0.05 mg／L，目前世界多國都面臨地下水的錳超標(biāo)問題[3-5]。生物除錳技術(shù)無需投加化學(xué)藥劑，有較高的除錳效率而且運(yùn)行管理費(fèi)用較低，逐漸取代物理和化學(xué)除錳法應(yīng)用于實(shí)際工程。但是，由于具有錳氧化能力的細(xì)菌在開放的環(huán)境中很難建立起種群優(yōu)勢，作為生物除錳技術(shù)核心的生物濾池在啟動(dòng)階段較長、抗沖擊負(fù)荷能力較弱。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，濾池的成熟過程往往需要4～6周[6,7]。細(xì)胞固定化技術(shù)可以將大量細(xì)菌固定在載體材料中，然后投入濾池中，從而實(shí)現(xiàn)在生物濾池中啟動(dòng)初期就有大量的錳氧化細(xì)菌，大大縮短除錳生物濾池的啟動(dòng)期并提高生物濾池的運(yùn)行穩(wěn)定性。

PVA是目前研究較多細(xì)胞固定的載體,它具有強(qiáng)度高、化學(xué)穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。PVA的缺點(diǎn)在于分子結(jié)構(gòu)中親水性羥基很多，羥基與水分子結(jié)合造成聚乙烯醇交聯(lián)后顆粒體積膨脹并發(fā)生粘連現(xiàn)象，而且交聯(lián)劑硼酸對細(xì)菌具有毒性[8-10]。李花子等[8]認(rèn)為PVA的粘連膨脹是由于硼酸上的3個(gè)羥基部分發(fā)生反應(yīng),交聯(lián)后的高聚物凝膠上殘留有親水性的羥基，采用延時(shí)包埋法和加入化學(xué)藥劑法,可改善PVA顆粒的水溶膨脹性。有些學(xué)者通過向PVA中添加海藻酸鈉、活性炭、沸石等物質(zhì)，研究改善PVA顆粒的粘連現(xiàn)象[10-13]。

本文通過分布交聯(lián)調(diào)pH法固定錳氧化細(xì)菌，該方法實(shí)施簡單，既充分利用了PVA和飽和硼酸易成型的優(yōu)點(diǎn)，又通過調(diào)節(jié)pH到弱堿性環(huán)境，使得硼酸以硼酸鹽的形式存在，降低了對細(xì)菌的傷害。經(jīng)硼酸鹽強(qiáng)化后的PVA在使用過程中的粘連、水溶膨脹性大大降低。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌源采集

菌源采集自北京工業(yè)大學(xué)北京市水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室除錳濾池。

1.1.2 培養(yǎng)基

PYCM 培養(yǎng)基[14]：蛋白胨為 0.8 g、酵母浸膏為0.2 g、MnSO4·H2O 為 0.45 g、K2HPO4為 0.1 g、檸檬酸 鐵 銨 為 2.0 g、NaNO3為 0.2 g、CaCl2為 0.1 g、（NH4）2CO3為 0.1 g，加去離子水 1 000 mL，加入 1.5%的瓊脂，在121℃下高壓滅菌20 min。

PYCM培養(yǎng)基稀釋液：將PYCM培養(yǎng)基加純水稀釋6倍，其中Mn2+濃度為25 mg／L。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

PVA（工業(yè)純，北京化工廠）；硼酸（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；海藻酸鈉（化學(xué)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；碳酸鈣（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司）；活性碳（天津市塘沽天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠）。

1.1.4 主要儀器

Sanyo高壓滅菌鍋、OLYMPUS BX41顯微鏡、AAS vario6型原子吸收分光光度計(jì)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、冰箱、水浴鍋、玻璃儀器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PVA固定化錳氧化細(xì)菌的制備

按照一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)將PVA加到去離子水中，在85～95℃水浴條件下邊攪拌邊溶解，在水浴鍋中邊加熱邊攪拌至溶解均勻的凝膠狀，冷卻至30～40℃，按照試驗(yàn)需要將一定量的添加劑（w%）與錳氧化細(xì)菌（v%）加到PVA溶液中，攪拌均勻，然后把PVA凝膠液裝入注射器中滴定到飽和硼酸溶液（若海藻酸鈉作添加劑，飽和硼酸中需加入2%CaCl2作為交聯(lián)劑）中，固定1 h，然后根據(jù)試驗(yàn)需要調(diào)節(jié)到一定pH，再次交聯(lián)一定時(shí)間，用孔徑為2 mm的篩網(wǎng)濾出小球，用生理鹽水洗凈，備用。

1.2.2 固定顆粒膨脹性的測定方法

體積膨脹率：體積膨脹率從一定程度上反映了固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性及耐用性，筆者經(jīng)過試驗(yàn)證實(shí)PVA固定顆粒在水中浸泡5 d后體積不再膨脹。取10 mL PVA小球放入裝有200 mL自來水的錐形瓶中浸泡5 d，每天定時(shí)測量其小球體積的變化。膨脹率=(浸泡后體積-初始體積)/初始體積。

1.2.3 固定顆粒機(jī)械強(qiáng)度的測定方法

機(jī)械強(qiáng)度的測定：首先在各組固定化小球中選取大小一致的小球各20顆，放入蒸餾水及玻璃球，在恒溫振蕩器中以200 r／min振蕩5 d，定時(shí)觀察小球的破損情況。記錄小球的破損個(gè)數(shù)，小球完好率=（總個(gè)數(shù)-破損個(gè)數(shù)）／總個(gè)數(shù)[15]。

1.2.4 固定錳氧化細(xì)菌活性的測定方法

將制備好的固定錳氧化細(xì)菌加入到30 mL PYCM培養(yǎng)基稀釋液中,120 r／min振蕩培養(yǎng)5 d，取2 mL水樣經(jīng)0.25 μm濾膜過濾，用原子吸收分光光度法測定剩余錳濃度。為排除培養(yǎng)基和載體的影響，分別用去離子水配制相同濃度的錳溶液和無細(xì)菌的載體顆粒做空白對照試驗(yàn)。錳細(xì)菌活性（相對活性）=（PYCM培養(yǎng)基稀釋液中Mn2+離子初始濃度-剩余Mn2+離子濃度）／PYCM培養(yǎng)基稀釋液中Mn2+離子初始濃度×100%。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 PVA濃度對固定細(xì)菌的影響

在二次交聯(lián)pH為9、二次交聯(lián)時(shí)間為12 h、包菌量為4%、加入4%碳酸鈣的條件下，改變PVA濃度制備固定錳氧化細(xì)菌，以考察PVA濃度對固定化細(xì)菌影響，如圖1所示。

通過5 d的膨脹率測定可知顆粒的膨脹程度隨PVA濃度的增加而增加，濃度為7%時(shí)膨脹率最低（55%）；濃度為12%時(shí)膨脹率最高（95%）；濃度為8%～10%時(shí)膨脹率變化較小。PVA顆粒交聯(lián)后化學(xué)結(jié)構(gòu)中殘留有親水性羥基，羥基與水分子結(jié)合造成PVA高分子相互交錯(cuò)結(jié)構(gòu)的解體，大量水分子滲透到PVA小球結(jié)構(gòu)內(nèi)部，并促使PVA小球結(jié)構(gòu)體膨脹。因此，PVA濃度越大吸收水分越多，解體后體積越大，膨脹率越大。經(jīng)5 d浸泡后PVA濃度越低的顆粒的機(jī)械強(qiáng)度越差，7%PVA顆粒的完好率為40%，而濃度12%顆粒的完好率為95%。PVA顆粒膨脹后PVA高分子間的距離加大，分子間的作用力減弱，造成機(jī)械強(qiáng)度的降低。PVA濃度越低，PVA高分子數(shù)量越少，膨脹后分子之間的相對距離越大，機(jī)械強(qiáng)度降低越快。固定細(xì)菌活性的大小往往與顆粒傳質(zhì)性有關(guān)，濃度越低的顆粒，內(nèi)部孔隙越大，傳質(zhì)性越高，特別是膨脹之后內(nèi)部含水率增加，傳質(zhì)性也迅速增加。

圖1 PVA濃度對固定細(xì)菌的影響Fig.1 Effect of Different Concentration of PVA on Immobilized Bacteria

由圖1可知顆粒內(nèi)部包埋細(xì)菌的活性隨著濃度的增加而降低，PVA濃度為7%、12%時(shí)，5 d除錳率分別為 88.12%、45.72%。PVA 濃度為 9%～11%時(shí)，細(xì)菌活性變化不大，穩(wěn)定在55%左右。

2.2 二次交聯(lián)pH對固定細(xì)菌的影響

在PVA濃度為9%、二次交聯(lián)時(shí)間為12 h，包菌量為4%、添加4%碳酸鈣的條件下，改變二次交聯(lián)pH制備固定錳氧化細(xì)菌，以考察二次交聯(lián)固定pH對固定化細(xì)菌影響，如圖2所示。

圖2 二次交聯(lián)pH對固定細(xì)菌的影響Fig.2 Effect of different pH Value of Second Cross-Link Procedure on Immobilized Bacteria

pH對PVA顆粒的物理性狀及化學(xué)結(jié)構(gòu)影響較大，安立超等[16]發(fā)現(xiàn)碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH值制備PVA載體固定化微生物的方法可增強(qiáng)固定化微生物載體的耐曝氣強(qiáng)度和機(jī)械強(qiáng)度。傳統(tǒng)飽和硼酸法交聯(lián)固定是在pH=5的酸性條件下進(jìn)行,對生物毒性大,細(xì)胞活性會(huì)受較大影響[17]。但相對于其他交聯(lián)劑，硼酸具有成型快的優(yōu)點(diǎn)，因此本試驗(yàn)采用二次交聯(lián)調(diào)pH法。首先在飽和硼酸中交聯(lián)1 h固定化細(xì)胞快速定型后，再將制備載體小球的交聯(lián)液pH值分別調(diào)為 5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00，二次交聯(lián)時(shí)間固定12 h。

由圖2可知二次交聯(lián)pH在5.00到7.00之間對膨脹率和機(jī)械強(qiáng)度沒有明顯作用，當(dāng)二次交聯(lián)pH達(dá)到 8.00、9.00、10.00 時(shí)膨脹率減小，機(jī)械強(qiáng)度也增加。程傳煊等[18]采用紅外光譜分析等手段證實(shí)，堿性環(huán)境下PVA部分羥基能夠發(fā)生脫質(zhì)子反應(yīng)與水中金屬離子發(fā)生配位反應(yīng)。由此可以判斷堿性環(huán)境有助于減少顆粒內(nèi)部羥基數(shù)量，使PVA顆粒膨脹和機(jī)械強(qiáng)度得到改善。當(dāng)pH為5.00～7.00時(shí)，固定細(xì)菌活性較低；當(dāng)pH為8和9時(shí)，活性最高，錳去除率分別為80%和75%；當(dāng)pH為10時(shí)，活性開始降低。分析原因：一方面是由于硼酸在酸性環(huán)境下的毒性較大；另一方面錳氧化細(xì)菌本身活性受pH影響較大。因此pH在7～9范圍內(nèi)有利于錳氧化細(xì)菌的活性保持[7]。

2.3 二次交聯(lián)時(shí)間對固定細(xì)菌的影響

在PVA濃度為9%、二次交聯(lián)pH為9.0、包菌量為4%、添加4%碳酸鈣的條件下，改變二次交聯(lián)時(shí)間制備固定錳氧化細(xì)菌，以考察二次交聯(lián)固定時(shí)間對固定化細(xì)菌影響，如圖3所示。

由于顆粒傳質(zhì)性的限制，堿性液體進(jìn)入顆粒內(nèi)部需要一定的時(shí)間，而且交聯(lián)反應(yīng)也需要足夠的時(shí)間。當(dāng)二次交聯(lián)時(shí)間為4～6 h時(shí)，反應(yīng)時(shí)間不足，顆粒膨脹性和機(jī)械強(qiáng)度未得到明顯改善；當(dāng)二次交聯(lián)時(shí)間為8～48 h時(shí)，二次交聯(lián)時(shí)交聯(lián)較好，膨脹率和機(jī)械強(qiáng)度分別穩(wěn)定在70%和85%左右。當(dāng)二次交聯(lián)時(shí)間在4～48 h變化時(shí)，固定細(xì)菌活性和交聯(lián)時(shí)間相關(guān)性不大，除錳率在45%左右，但是由于營養(yǎng)物質(zhì)限制，二次交聯(lián)時(shí)間不宜超過48 h。

2.4 添加劑對固定細(xì)菌的影響

在PVA濃度為9%、二次交聯(lián)pH為9.0、二次交聯(lián)時(shí)間為12 h、包菌量為4%的條件下，分別加入不同添加劑制備固定錳氧化細(xì)菌，如圖4所示。

圖3 二次交聯(lián)時(shí)間對固定細(xì)菌的影響Fig.3 Effect of Different Time of Second Cross-Link Procedure on Immobilized Bacteria

圖4 添加劑對固定細(xì)菌的影響Fig.4 Effect of Different Co-Composite Matters on Immobilized Bacteria

四種添加劑中碳酸鈣、活性炭對膨脹性的改善效果最好，膨脹率分別為61%和95%。這是因?yàn)橐环矫娌蝗苄缘奶妓徕}和活性炭具有“位阻”作用，能夠阻止水中的氫離子（H+）與PVA分子上的羥基（-OH）結(jié)合[19]；另一方面碳酸鈣作為一種弱酸鹽，在水溶液中pH為9.5～10.2，能夠?yàn)镻VA分子創(chuàng)造微堿性環(huán)境，堿性環(huán)境下水中氫離子數(shù)量減少，可有效改善PVA的水溶膨脹。海藻酸鈉和瓊脂加速了PVA的水溶膨脹。海藻酸鈉交聯(lián)后形成的海藻酸鈣會(huì)與水中的K+、Na+、Mg2+等陽離子發(fā)生置換反應(yīng)而溶解[20]。瓊脂長期浸泡過程中添加劑自身會(huì)吸收大量水分，而且瓊脂會(huì)慢慢脫離載體而溶解到水中。

碳酸鈣、海藻酸鈉、瓊脂對PVA機(jī)械強(qiáng)度的改善較好，5 d小球完好率都在70%以上。加入活性炭的PVA凝膠的機(jī)械強(qiáng)度較差，小球5 d完好率僅為45%，可能是由于活性炭的加入破壞了PVA交聯(lián)后所形成的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

碳酸鈣的加入影響到固定化錳氧化細(xì)菌微環(huán)境的pH，錳細(xì)菌氧化錳離子需要pH在7～9范圍內(nèi)，碳酸鈣5 d除錳率只有64%。海藻酸鈉、瓊脂、活性炭的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對錳氧化細(xì)菌微環(huán)境的pH和orp影響微小，這三種添加劑可以增大PVA小球的孔隙度和傳質(zhì)性，有助于提高固定錳氧化細(xì)菌活性，5 d除錳率保持在75%左右。同時(shí)，活性炭具有微生物沒有的能力，能將底物吸附到內(nèi)部微孔內(nèi)，并逐漸釋放，吸附的物質(zhì)90%被降解[21]。

2.5 包菌量對固定細(xì)菌的影響

在PVA濃度為9%、二次交聯(lián)pH為9.0，二次交聯(lián)時(shí)間為12 h、加入4%碳酸鈣的條件下，分別加入不同體積的菌液制備固定錳氧化細(xì)菌，如圖5所示。

圖5 包菌量對固定細(xì)菌的影響Fig.5 Effect of Amount of Embedded Bacteria on Immobilized Bacteria

當(dāng)包菌量在1%～8%變化時(shí)，對膨脹性影響不大，膨脹率穩(wěn)定在66%～73%。機(jī)械強(qiáng)度在包菌量小于4%時(shí)變化較小。但是當(dāng)包菌量大于4%時(shí)機(jī)械強(qiáng)度有明顯的下降趨勢，說明加入菌液體積比超過4%，會(huì)對PVA交聯(lián)后的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響。

固定細(xì)菌的除錳能力與包菌量具有明顯的相關(guān)性，錳去除率隨著包菌量的增加而增加。這是因?yàn)榘竦募?xì)菌越多，固定后活細(xì)菌數(shù)量越多。此外，錳氧化細(xì)菌體液內(nèi)含大量具有催化活性的酶，細(xì)菌死亡解體后將酶釋放到周圍環(huán)境中，細(xì)菌數(shù)量越多，環(huán)境中的錳氧化酶越多，除錳能力也越高。

3 結(jié)論

（1）顆粒的膨脹度及機(jī)械強(qiáng)度隨PVA濃度的增加而增加，由于傳質(zhì)性的影響顆粒內(nèi)部包埋細(xì)菌的活性隨著濃度的增加而降低。

（2）堿性環(huán)境有助于減少顆粒內(nèi)部羥基數(shù)量，使PVA顆粒膨脹和機(jī)械強(qiáng)度得到改善，二次交聯(lián)pH在5.00到7.00之間對膨脹率和機(jī)械強(qiáng)度沒有明顯作用，在二次交聯(lián) pH 達(dá)到 8.00、9.00、10.00 時(shí)膨脹率減小，機(jī)械強(qiáng)度也增加。pH 在 5.00～7.00時(shí)固定細(xì)菌活性較低，pH為8和9時(shí)活性最高，pH為10時(shí)的活性開始降低。

（3）二次交聯(lián)時(shí)間為4～6 h時(shí)，反應(yīng)時(shí)間不足，顆粒膨脹性和機(jī)械強(qiáng)度未得到明顯改善。二次交聯(lián)時(shí)間為8～48 h時(shí)，膨脹率和機(jī)械強(qiáng)度分別穩(wěn)定在70%和85%左右。二次交聯(lián)時(shí)間在4～48 h變化時(shí)，固定細(xì)菌活性和交聯(lián)時(shí)間相關(guān)性不大，但不宜超過48 h。

（4）四種添加劑中碳酸鈣、活性炭對膨脹性的改善效果最好，膨脹率分別為61%和95%。碳酸鈣、海藻酸鈉、瓊脂對PVA機(jī)械強(qiáng)度的改善較好。海藻酸鈉、瓊脂、活性炭有助于提高固定錳氧化細(xì)菌活性。碳酸鈣的加入影響到固定化錳氧化細(xì)菌微環(huán)境的pH，固定錳氧化細(xì)菌活性較低。

（5）包菌量在1%～8%變化時(shí)，對膨脹性影響不大，機(jī)械強(qiáng)度在包菌量小于4%時(shí)變化較?。划?dāng)包菌量大于4%時(shí)機(jī)械強(qiáng)度有明顯的下降趨勢，錳去除率隨著包菌量的增加而增加。

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