張玉姣 唐 乾 曹洪玉 鄭學(xué)仿,2,*

(1大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連116622;2大連大學(xué)遼寧省生物有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116622)

1 引言

長(zhǎng)期以來,體外模擬反應(yīng)大都是在稀溶液中進(jìn)行,而真實(shí)的細(xì)胞內(nèi)是高度擁擠的.細(xì)胞內(nèi)含有大量的多糖、蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì),這些大分子以不同濃度存在于細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)所有大分子的濃度估計(jì)高達(dá)80-200 g·L-1,1細(xì)胞容積的20%-30%都被大分子占用.最近,提出分子伴侶概念的Ellis教授2呼吁生物學(xué)家們?cè)谘芯矿w系中一定要加入細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)濃度的擁擠試劑以模擬細(xì)胞內(nèi)大分子擁擠環(huán)境.Sasahara等3在低pH的擁擠條件下研究脫輔基肌紅蛋白構(gòu)象變化,發(fā)現(xiàn)擁擠試劑可以促進(jìn)去折疊的蛋白質(zhì)折疊為更為緊致的結(jié)構(gòu),擁擠試劑的存在增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性.McPhie等4在擁擠條件下研究脫輔基肌紅蛋白的構(gòu)象變化,發(fā)現(xiàn)大分子擁擠試劑濃度的增加能促進(jìn)去折疊的脫輔基肌紅蛋白向熔球態(tài)轉(zhuǎn)變,且這種現(xiàn)象與溫度無關(guān),但擁擠條件下全輔基肌紅蛋白的去折疊是什么過程?是否與脫輔基的肌紅蛋白一致?

另外,人們一直認(rèn)為蛋白表面的氨基酸殘基暴露在溶劑中,對(duì)蛋白的穩(wěn)定性影響甚微.但最近幾年研究成果對(duì)這一觀念提出了質(zhì)疑,Hoffman及其團(tuán)隊(duì)5已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌紅蛋白三突變體(三個(gè)表面的酸性氨基酸Asp44,Asp60,Glu85突變?yōu)橘嚢彼?顯著增強(qiáng)肌紅蛋白與細(xì)胞色素b5復(fù)合體的結(jié)合能力及復(fù)合體內(nèi)部電子轉(zhuǎn)移.而且他們也發(fā)現(xiàn)馬心肌肌紅蛋白44位天冬氨酸突變?yōu)橘嚢彼岷?突變體肌紅蛋白與細(xì)胞色素b5之間的電子傳遞速率增強(qiáng)了一個(gè)級(jí)別,6我們課題組已經(jīng)探討過肌紅蛋白及突變體(D44K,D60K)與各種配體的相互作用,如與表面活性劑7,8以及氧化劑9等,均已證明突變體在與這些配體的作用中有別于野生型蛋白.在擁擠條件下突變體蛋白的去折疊過程是否有別于野生型蛋白呢?因此,本文利用多種光譜學(xué)手段研究大分子擁擠條件下全輔基肌紅蛋白及突變體D60K去折疊過程,通過比較酸穩(wěn)定性特點(diǎn),研究不同環(huán)境以及表面氨基酸的改變對(duì)蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響.本項(xiàng)研究可對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性維持和蛋白質(zhì)折疊病的研究提供可靠的理論基礎(chǔ).

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

馬心肌紅蛋白樣品(美國Sigma公司)UV-Vis吸收光譜特征峰表明幾乎全部為高鐵肌紅蛋白,使用時(shí)用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(0.05 mol·L-1)配制成濃度為5.0×10-6mol·L-1的溶液(避光保存并盡快用于實(shí)驗(yàn)),突變體Mb(D60K)樣品(通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后,微生物培養(yǎng)法獲得,純度達(dá)96%以上)濃度為5.0×10-6mol·L-1,Ficoll70及Dextran70購于上海生物工程公司,均為國產(chǎn)分析純.

V-560型UV-Vis分光光度計(jì)、FP-6500型熒光分光光度計(jì)、J-810型圓二色分光光度計(jì)(均購自日本Jasco公司);F-12型制冷和加熱循環(huán)器(德國Julabo公司).

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 突變體D60K的獲取

細(xì)胞培養(yǎng):將含有Mb(D60K)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽性克隆,接種到添加100 mg·L-1的溶菌肉(LB)培養(yǎng)基中大量培養(yǎng),接種量為1%;離心收集細(xì)胞于-18°C凍存?zhèn)溆?

提取:取出凍存的細(xì)胞在室溫溶解,加入溶菌酶,攪拌,冰浴2-4 h,再加入鏈霉素并攪拌至細(xì)胞提取液為稀溶液.反復(fù)清洗細(xì)胞碎片,離心收集紅色上清液(6000 r·min-1,30 min,4 °C).

純化:采用硫酸銨分步沉淀.第1步硫酸銨飽和度65%,2 h.第2步硫酸銨飽和度是95%,過夜.離心收集到的沉淀透析除鹽,濃縮.濃縮液經(jīng)過離子交換柱DEAE-Sepharose(1.6 cm×20 cm,pH 7.4,含有1.0×10-3mol·L-1乙二胺四乙酸鈉(EDTA)的 Tris-HCl緩沖液).洗脫液再經(jīng)過Sephadex G-75凝膠柱(1.6 cm×50 cm)純化.最后得到的純度達(dá)到96%的D60K肌紅蛋白,超濾濃縮后-80°C保存.

2.2.2 樣品前期處理

將Mb溶解在不同pH值(6.5,6.0,5.5,5.0,4.5,4.0,3.5,3.0)的 0.05 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,蛋白終濃度達(dá)到5.0×10-6mol·L-1,對(duì)照組分別添加Ficoll70與Dextran70,使其終濃度達(dá)到100 g·L-1,室溫放置1.5 h后進(jìn)行光譜測(cè)定;Mb(D60K)處理同上.

2.2.3 UV-Vis吸收光譜

將已處理的Mb(WT)和Mb(D60K)樣品置于1 cm石英比色池中進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定條件為:狹縫寬度為2 nm,掃描波長(zhǎng)范圍220-700 nm,掃描速率200 nm·min-1,響應(yīng)時(shí)間中等.

2.2.4 同步熒光光譜

將已處理的Mb(WT)和Mb(D60K)樣品置于1 cm石英比色池中進(jìn)行同步熒光光譜測(cè)定,測(cè)定條件為:激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別為3和5 nm,掃描速率為500 nm·min-1,響應(yīng)時(shí)間為0.5 s,檢測(cè)器靈敏度為中等,控制溫度(25.00±0.01)°C.

2.2.5 CD光譜

將已處理的Mb(WT)和Mb(D60K)樣品置于1 mm石英比色池中進(jìn)行圓二色譜測(cè)定,測(cè)定條件為:狹縫寬度為1 nm,掃描波長(zhǎng)范圍為190-250 nm,掃描速率為50 nm·min-1,響應(yīng)時(shí)間為2 s,累計(jì)次數(shù)為3次.

3 結(jié)果與討論

3.1 Mb(WT)UV-Vis吸收光譜

Mb(WT)的UV-Vis吸收光譜受血紅素周圍微環(huán)境的影響,天然狀態(tài)的Mb(WT)溶液在409 nm(Soret)帶、503 nm(Q帶)、630 nm(金屬電子配體轉(zhuǎn)移(LMCT)帶)處有特征吸收峰,這分別是血紅素的中心鐵原子與吡咯環(huán)的四個(gè)氮原子形成配位鍵,第五配位結(jié)合His-93殘基,第六配位結(jié)合一個(gè)水分子形成的6-cHs(六配位高自旋結(jié)構(gòu)),aquometMb的特征吸收譜帶.10圖1A為稀溶液中酸誘導(dǎo)Mb(WT)去折疊過程的紫外-可見吸收光譜,在pH 6.5→pH 5.5,Soret帶吸光值逐漸增大,pH 5.5→pH 4.0,Soret帶的吸光值逐漸下降,當(dāng)pH為4.0時(shí)Soret帶的吸光值迅速下降且藍(lán)移至370.5 nm處,該過程中503 nm處的Q帶與630 nm處的LMCT帶峰位置沒有發(fā)生改變,當(dāng)pH為3.5時(shí),503 nm處Q帶紅移到513 nm,630 nm處的LMCT帶紅移到644 nm處.Dextran70存在時(shí),pH 6.5→pH 5.5的Soret帶變化過程與未加擁擠試劑時(shí)相同,但pH降到4.0時(shí),Soret帶強(qiáng)度下降幅度較大但峰位置沒有改變.當(dāng)pH降為3.5時(shí),Soret帶由409 nm藍(lán)移至370.5 nm處,同時(shí)503 nm處的Q帶與630 nm處的LMCT帶分別紅移到512和638.5 nm處,543 nm處出現(xiàn)新的吸收峰.當(dāng)pH降為3.0時(shí)638.5 nm處的吸收峰紅移到644 nm.Ficoll70存在時(shí),pH 6.5→pH 3.5,Soret帶變化過程與Dextran70存在時(shí)相同,但630 nm處LMCT帶變化過程與Dextran70存在時(shí)不同,pH 3.5時(shí)630 nm處吸收峰位置沒有發(fā)生改變,pH為3.0時(shí)630 nm處的吸收峰紅移到644 nm.

pH 6.5→pH 5.5血紅素周圍疏水微環(huán)境發(fā)生變化,血紅素中的二價(jià)鐵與水相互作用被氧化成高價(jià)鐵,從而形成了高鐵肌紅蛋白,使得409 nm處吸收峰值增大.隨著pH值繼續(xù)降低,氨基酸基團(tuán)質(zhì)子化造成了血紅素結(jié)合位點(diǎn)的改變,并使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了巨大的改變,11表現(xiàn)為血紅素輔基脫離肽鏈導(dǎo)致409 nm處吸收峰藍(lán)移至370.5 nm處.503 nm處Q帶吸收峰紅移主要是由于氫離子進(jìn)入血紅素疏水中心,由Gouterman的四軌道模型12和Q帶與配體供電子能力的關(guān)系可知,溶液供電子能力增加導(dǎo)致肌紅蛋白Q帶紅移.LMCT帶由630 nm紅移到644 nm,主要是由于氫離子進(jìn)入血紅素活性中心,氫離子與肌紅蛋白相互作用增強(qiáng)使得Fe-His-93位的配位鍵斷裂,高鐵肌紅蛋白(metMb)在血紅素活性位點(diǎn)處形成五配位高自旋結(jié)構(gòu).13Dextran70存在時(shí)Soret帶藍(lán)移、Q帶與LMCT帶紅移時(shí)所處的pH值低于稀溶液,產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因是由于Dextran70是無交聯(lián)的線性大分子,14在溶液中形成準(zhǔn)隨機(jī)螺旋,存在很多可以容納分子的間隙空間,對(duì)Mb(WT)產(chǎn)生不同的排阻體積,降低了血紅素與肽鏈的解離速度,對(duì)Fe-His-93位配位鍵起到了一定的穩(wěn)定作用,從而對(duì)吸收峰轉(zhuǎn)移過程起到了延遲作用.Ficoll70存在時(shí)630 nm處LMCT帶紅移過程遲于Dextran70存在的變性溶液,Ficoll70是高度交聯(lián)共聚體,產(chǎn)生的排阻體積明顯大于Dextran70,阻礙了氫離子進(jìn)入血紅素活性中心,減弱了氫離子與肌紅蛋白相互作用,降低了Fe-His-93位的配位鍵斷裂所處的pH值.

圖1 擁擠條件下Mb(WT)在不同pH溶液中的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorbance spectra of Mb(WT)as a function of pH under macromolecular crowding conditions

3.2 Mb(WT)圓二色光譜

通過CD光譜可以靈敏地檢測(cè)反應(yīng)引起的蛋白分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化.在蛋白質(zhì)或多肽的規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)中,肽鍵是高度有規(guī)律排列的,排列的方向決定了肽鍵能級(jí)躍遷的分裂情況,因此具有不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生的CD譜帶的位置、吸收的強(qiáng)弱都不相同.

我們用遠(yuǎn)紫外區(qū)圓二色光譜技術(shù)檢測(cè)Mb(WT)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化情況,并用楊氏方程算法15計(jì)算Mb(WT)中的α螺旋、β折疊等含量變化.208和222 nm處兩個(gè)負(fù)槽,反映的是α螺旋的光譜特性.16圖2為酸誘導(dǎo)Mb(WT)去折疊過程的圓二色光譜,稀溶液中pH 6.5→pH 4.5,Mb(WT)208和222 nm處的負(fù)槽強(qiáng)度下降但形狀和肩峰的位置沒有發(fā)生明顯的改變.蛋白質(zhì)在此pH值范圍內(nèi)沒有變性,整個(gè)蛋白分子結(jié)構(gòu)仍以α螺旋為主,在pH 4.5時(shí)無擁擠試劑的Mb(WT)二級(jí)結(jié)構(gòu)有較大改變,α螺旋含量下降13.9%,這主要是由于大量的氫離子作用于肌紅蛋白表面使蛋白伸展并暴露出疏水殘基干擾蛋白的螺旋結(jié)構(gòu),更多的β折疊及無規(guī)則卷曲可溶性暴露結(jié)構(gòu)出現(xiàn).隨著酸度的增強(qiáng)蛋白質(zhì)表面的正電荷增強(qiáng)使得位于蛋白表面的親水性側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生了明顯的變化,維系二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵作用力被破壞,對(duì)酸敏感的二級(jí)結(jié)構(gòu)(α-螺旋及伸展肽鏈)開始解離,17β折疊、無規(guī)則卷曲含量在增加,蛋白質(zhì)的有序度在降低,無序度在增加.18與稀溶液相比,擁擠試劑Dextran70與Ficoll70存在的蛋白溶液的負(fù)槽強(qiáng)度減弱程度低很多,但其二級(jí)結(jié)構(gòu)仍遭到破壞,在pH 4.5時(shí)α螺旋含量分別下降9.5%、4.5%,此時(shí)擁擠試劑形成了高度擁擠的狀態(tài)降低了氫離子的擴(kuò)散系數(shù),阻礙了氫離子的運(yùn)動(dòng),減弱了氫離子與蛋白質(zhì)之間的相互作用力,蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變值明顯低于無擁擠試劑的蛋白質(zhì)溶液,擁擠試劑的加入對(duì)肌紅蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)起到了保護(hù)作用.pH降到4.0時(shí)稀溶液中蛋白在208和222 nm處兩個(gè)負(fù)槽的形狀與強(qiáng)度發(fā)生了明顯的改變,而Dextran70與Ficoll70存在的溶液基本沒有發(fā)生改變,pH降到3.5時(shí)擁擠試劑存在的蛋白溶液的負(fù)槽形狀與強(qiáng)度發(fā)生明顯改變,蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞,CD光譜檢測(cè)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化過程與紫外-可見光譜檢測(cè)的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的變化過程相一致.

圖2 擁擠條件下Mb(WT)在不同pH溶液的圓二色光譜Fig.2 CD spectra of Mb(WT)as a function of pH under macromolecular crowding conditions

3.3 Mb(WT)紫外數(shù)據(jù)歸一化處理

圖3為擁擠條件下Mb(WT)在不同pH溶液中409 nm處吸收值的變化圖譜,通過紫外光譜與CD光譜可以清楚地看到稀溶液與擁擠條件下Mb(WT)血紅素輔基以及肽鏈的變化情況,為了更精確地比較擁擠試劑加入前后蛋白去折疊過程的差異,依據(jù)文獻(xiàn)19計(jì)算出變性中點(diǎn)pH(pH1/2),計(jì)算結(jié)果顯示稀溶液中Mb(WT)酸變性中點(diǎn)pH1/2(Mb)=4.25,Dextran70存在時(shí)pH1/2(Mb)=3.78,Ficoll70存在時(shí)pH1/2(Mb)=3.76.由此可見,擁擠試劑加入后Mb(WT)酸變性中點(diǎn)pH明顯下降,Mb(WT)的耐酸性提高,擁擠試劑具有酸變性過程中穩(wěn)定肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的作用.

圖3 擁擠條件下Mb(WT)在不同pH溶液中409 nm處歸一化吸收值的變化Fig.3 Normalized absorption values of Mb(WT)at 409 nm as a function of pH under macromolecular crowding conditions

3.4 Mb(WT)熒光相圖分析

熒光相圖法是根據(jù)內(nèi)源熒光發(fā)射光譜特定部位的熒光強(qiáng)度作圖,進(jìn)而直觀地獲得蛋白質(zhì)去折疊結(jié)構(gòu)變化信息的方法.20發(fā)射波長(zhǎng)分別為λ1和λ2的熒光強(qiáng)度分別為I(λ1)和I(λ2).變量間存在以下三個(gè)關(guān)系式:21-23

式中a和b分別為I(λ1)對(duì)I(λ2)作圖所得直線的截距和斜率,I1(λ1)和 I2(λ1)分別為λ1條件下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)始態(tài)和終態(tài)的熒光強(qiáng)度,I1(λ2)和I2(λ2)則分別是發(fā)射波長(zhǎng)為λ2條件下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)始態(tài)和終態(tài)的熒光強(qiáng)度.分別選取波長(zhǎng)為320和365 nm處的熒光強(qiáng)度為研究對(duì)象.

若蛋白質(zhì)去折疊過程符合“全或無模型”或“二態(tài)模型”,熒光相圖表現(xiàn)為一條直線;若符合“三態(tài)”或“多態(tài)”模型,熒光相圖分別表現(xiàn)為兩條或多條直線.24-26

圖4A為稀溶液中酸誘導(dǎo)Mb(WT)去折疊過程熒光相圖,該熒光相圖表現(xiàn)為一條直線,表明稀溶液中隨著酸度增強(qiáng)Mb(WT)發(fā)生去折疊且去折疊過程為“二態(tài)”模型.圖4B、圖4C為擁擠試劑加入后Mb(WT)去折疊過程熒光相圖,該熒光相圖仍舊為一條直線,擁擠試劑的加入沒有增加Mb(WT)去折疊過程的中間態(tài),圖中各pH值所對(duì)應(yīng)的熒光相圖結(jié)果與紫外光譜、CD光譜變化結(jié)果相一致.

通過光譜數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)計(jì)算結(jié)果可以看出:擁擠試劑的加入對(duì)Mb(WT)的空間構(gòu)象以及氨基酸的微環(huán)境起到了很好的保護(hù)作用,而突變體Mb(D60K)的酸變性過程又是怎樣呢?

3.5 Mb(D60K)UV-Vis吸收光譜

圖4 擁擠條件下Mb(WT)在不同pH溶液中的熒光相圖Fig.4 Fluorescence phase diagram of Mb(WT)as a function of pH under macromolecular crowding conditions

圖5A為稀溶液中酸誘導(dǎo)Mb(D60K)去折疊過程紫外-可見吸收光譜,肌紅蛋白60位Asp突變?yōu)長(zhǎng)ys后其去折疊過程與野生型有一定的區(qū)別,D60K約在542、580 nm處有特征吸收峰,此處是還原型蛋白的特征吸收峰,pH 6.5→pH 4.5,Soret帶的變化過程與野生型相同,pH為4.0時(shí)Mb(D60K)409 nm處吸收峰藍(lán)移至387 nm處(Mb(WT)則藍(lán)移至370.5 nm)且503、542以及約580 nm處吸收峰消失,630 nm處吸收峰紅移到644 nm處,當(dāng)pH為3.5時(shí)409 nm處最大吸收峰藍(lán)移至370.5 nm.上述現(xiàn)象產(chǎn)生的原因主要是隨著酸度增強(qiáng),溶液的pH值小于賴氨酸的等電點(diǎn)時(shí),Mb(WT)的Lys-60上―NH2全都變?yōu)楱DNH3+,蛋白表面整體偏正電荷,而溶液pH值大于天冬氨酸的等電點(diǎn)時(shí),Asp-60上的―COOH全都變?yōu)楱DCOO-,蛋白表面偏負(fù)電荷;Mb的60位Asp突變?yōu)長(zhǎng)ys改變了蛋白質(zhì)表面的電荷,弱化了蛋白質(zhì)表面電荷受pH值的影響,蛋白質(zhì)與氫離子之間的相互作用減弱,從而延遲了最大吸收峰移動(dòng).

圖5 擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液中的UV-Vis吸收光譜Fig.5 UV-Vis absorbance spectra of Mb(D60K)as a function of pH under macromolecular crowding conditions

圖6 擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液的圓二色光譜Fig.6 CD spectra of Mb(D60K)as a function of pH under macromolecular crowding conditions

Dextran70存在時(shí),pH 6.5→pH 4.5,各吸收峰變化過程與稀溶液相同,pH為4.0時(shí),409 nm處最大吸收峰強(qiáng)度稍有下降但位置沒有發(fā)生改變,542、580 nm處吸收峰消失但503 nm處Q帶吸收峰與630 nm處的電子轉(zhuǎn)移帶沒有發(fā)生改變(稀溶液中409 nm處最大吸收峰藍(lán)移至387 nm)且503、542 nm以及580 nm處吸收峰消失,630 nm處吸收峰紅移到644 nm處.當(dāng)pH降為3.5時(shí),最大吸收峰藍(lán)移至373.5 nm處且503 nm處的吸收峰消失,藍(lán)移程度都明顯低于無擁擠試劑存在的Mb(D60K)溶液,pH降為3.0時(shí)最大吸收峰藍(lán)移至370.5 nm,此時(shí)蛋白質(zhì)已變性,血紅素輔基完全脫離肽鏈.擁擠試劑Dextran70形成高度擁擠的環(huán)境降低了氫離子的擴(kuò)散系數(shù),減弱了氫離子與蛋白質(zhì)的相互作用,從而延遲了蛋白質(zhì)的變性過程.

Ficoll70存在時(shí),pH 6.5→pH 3.5各吸收峰強(qiáng)度及峰位置基本沒有變化,當(dāng)pH降到3.0時(shí),409 nm處吸收峰強(qiáng)度迅速下降且藍(lán)移至370.5 nm處,503 nm處Q帶吸收峰以及約542、580 nm處吸收峰消失,但630 nm處的LMCT帶未發(fā)生改變,中間沒有經(jīng)歷任何中間態(tài),說明擁擠試劑Ficoll70的加入增強(qiáng)了突變體Mb(D60K)的酸穩(wěn)定性且擁擠試劑Ficoll70對(duì)Mb(D60K)的穩(wěn)定效果明顯強(qiáng)于Dextran70.

3.6 Mb(D60K)圓二色光譜

圖6為擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液的圓二色光譜,稀溶液中pH 6.5→pH 4.5,D60K酸變性過程與Mb(WT)相同,但pH 4.5時(shí)α螺旋含量下降6.2%,改變值明顯低于Mb(WT);擁擠試劑Dextran70存在時(shí)pH 6.5→pH 4.0,208和222 nm處的負(fù)槽強(qiáng)度基本沒有變化,但在pH 4.0時(shí)其α螺旋含量下降5.8%;Ficoll70存在時(shí)pH 6.5→pH 3.5,208和222 nm處的負(fù)槽強(qiáng)度基本沒有變化,只有在pH 3.0時(shí)負(fù)槽強(qiáng)度發(fā)生明顯變化,此時(shí)α螺旋含量下降7.4%.表面氨基酸突變與擁擠試劑的加入均增強(qiáng)了Mb(D60K)二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性.

圖7 擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液中409 nm處吸收值的變化Fig.7 Normalized absorption value of Mb(D60K)at 409 nm as a function of pH under macromolecular crowding conditions

3.7 Mb(D60K)紫外數(shù)據(jù)歸一化處理

圖7為擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液中409 nm處吸收值的變化圖譜,通過譜圖數(shù)據(jù)計(jì)算D60K變性的中點(diǎn)pH,稀溶液中pH1/2(D60K)=4.19,Dextran70存在時(shí)pH1/2(D60K)=3.74,Ficoll70存在時(shí)pH1/2(D60K)=3.12.從上述數(shù)據(jù)可以看出肌紅蛋白第60位天冬氨酸突變?yōu)橘嚢彼岷笏嶙冃灾悬c(diǎn)降低,Dextran70存在時(shí)Mb(D60K)的變性中點(diǎn)pH值降低10.74%,Ficoll70存在時(shí)變性中點(diǎn)pH值降低了25.72%,擁擠試劑具有降低蛋白質(zhì)酸變性中點(diǎn)的作用.

圖8 擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液的熒光相圖Fig.8 Fluorescence phase diagram of Mb(D60K)as a function of pH under macromolecular crowding conditions

3.8 酸誘導(dǎo)Mb(D60K)去折疊過程熒光相圖分析

圖8為擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液的熒光相圖,從圖中可以看出添加了擁擠試劑后Mb(D60K)去折疊過程仍為二態(tài)過程,擁擠試劑的加入并未增加Mb(D60K)去折疊中間態(tài),擁擠試劑對(duì)Mb(D60K)的去折疊中間態(tài)沒有影響.

4 結(jié)論

本文通過加入大分子擁擠試劑,模擬高度擁擠的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,研究酸誘導(dǎo)Mb(WT)及其突變體Mb(D60K)去折疊過程,結(jié)果顯示肌紅蛋白表面60位天冬氨酸突變?yōu)橘嚢彼岷笤鰪?qiáng)了肌紅蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性;大分子擁擠試劑加入后Mb(WT)及其突變體的去折疊過程明顯不同于稀溶液,擁擠試劑提高了Mb(WT)及Mb(D60K)的酸變性中點(diǎn)且Ficoll70對(duì)Mb(D60K)耐酸性的提高效果尤為顯著.肌紅蛋白表面氨基酸突變以及擁擠試劑的添加起到了穩(wěn)定血紅素微環(huán)境、芳香族氨基酸、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和保護(hù)蛋白天然狀態(tài)的作用,為以后擁擠條件下蛋白質(zhì)去折疊過程的研究提供參考依據(jù).

Supporting Information: The original data of fluorescence emission spectrum are used to calculate the fluorescence phase diagram of Mb(WT)induced by acid.This information is available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.

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