李迪諾 王玉彬 王貴軍 馬艷梅 金 玥 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸外科，遼寧 錦州 121001)

恩度作為國產(chǎn)抗血管生成藥物對腫瘤血管生成具有抑制作用〔1〕，被廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的輔助靶向治療〔2〕，具有多靶點療效可靠、副作用小、為細胞殺傷藥物增敏等優(yōu)點〔3〕。順鉑作為細胞毒性藥物，在惡性腫瘤治療中療效被廣泛認可〔4〕。本研究將兩種藥物相結(jié)合應(yīng)用于裸鼠胃癌種植瘤，觀察對細胞凋亡與腫瘤微血管生成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要動物與試劑 Balb/c裸鼠購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于遼寧醫(yī)學(xué)院SPF級實驗動物中心;人胃癌細胞株SGC-7901購自協(xié)和細胞庫，RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司;Trizol試劑、RT-PCR試劑盒、Marker等均購自TaKaRa公司;PV二步法免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋公司;兔抗人 ID1、VEGF、CD34單克隆抗體及二抗IgG-HRP、β-actin均購自美國Santa Cruz公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。重組人血管內(nèi)皮抑制素恩度、購自于煙臺先聲麥得津公司，順鉑購自錦州九泰藥業(yè);引物序列:ID1:正鏈5'-CAAGTGGCCAGAGGCATGCACTT-3'，負 鏈 5'-GATGTAGTCTTTACCATCCTGTTG-3';VEGF:正鏈5'-GAAGTGGTGAAGTTCAT-GGATGTC-3'，負鏈 5'-CGATCGTTCTGTATCACTCTTTCC-3'。引物由TaKaRa公司設(shè)計并合成。

1.2 人胃癌裸鼠種植瘤 用含有10%胎牛血清的RMPI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2孵箱里常規(guī)培養(yǎng)，細胞長至80%培養(yǎng)瓶面積時，以0.25%胰酶37℃消化1 min，倒去胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基，吹打至單細胞懸液，分裝傳代。傳代3次，將SGC-7901細胞懸液種植于32只裸鼠腋窩皮下。

1.3 分組 Balb/c荷瘤裸鼠隨機分四組，每組8只，成瘤直徑0.8 cm后采用恩度及順鉑分別干預(yù):對照組不處理，實驗組1予5 mg/kg順鉑干預(yù);實驗組2予5 mg/kg恩度干預(yù);實驗組3予5 mg/kg恩度聯(lián)合5 mg/kg順鉑干預(yù)。恩度隔1 d瘤周皮下給藥一次，順鉑隔3 d腹腔給藥一次，療程4 w，開始治療后每日觀察裸鼠活動、攝食及飲水情況，每周用稱體重。

1.4 取材 治療4 w后，停藥1 w，用水合氯醛麻醉處死裸鼠。取出腫瘤組織，檢測體積及稱重。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測 瘤組織蠟塊包埋，切片，脫蠟，抗原修復(fù)。一抗兔抗人CD34用PBS以1∶50稀釋，同時設(shè)PBS代替一抗作為陰性對照。二抗羊抗兔IgG-HRP以1∶200稀釋。DAB顯色，樹膠封片觀察。陽性標準為胞質(zhì)及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，證實胃癌細胞表達CD34蛋白，微血管密度(MVD)采用Weidner微血管計數(shù)方法。

1.6 RT-PCR測定ID1、VEGF基因表達 各組新鮮冰凍組織標本按照RT-PCR試劑盒操作步驟，總RNA提取和RT-PCR擴增。循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性10 min，94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸 2 min，30個循環(huán)之后，72℃再延伸 8 min。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳分離，紫外分析儀觀察后攝片。Lab Works軟件進行凝膠成像分析，測定陽性電泳條帶的平均灰度值，計算各樣本目的基因與β-actin電泳條帶的平均灰度值比值，作為其相對表達量。

1.7 Western印跡免疫印跡檢測ID1、VEGF蛋白的表達 各組新鮮冰凍組織標本，預(yù)冷PBS洗3次后加入400 μl裂解液，冰上裂解細胞30 min，4℃ 14 000 r/min×5 min，提取上清測定蛋白質(zhì)濃度后進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，含5%BSA的TBST室溫封閉1 h，加入 ID1、VEGF 與 β-actin 抗體(1∶500)，4℃ 搖床過夜，加入二抗(1∶1 000)雜交，洗膜后顯色。

1.8 透射電鏡檢測瘤組織凋亡情況 經(jīng)4%戊二醛固定樣品，0.1 mol/L PBS清洗 3次，每次 15 min;鋨酸固定 2 h;0.1 mol/L PBS清洗3次，每次15 min。分別30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脫水，每次20 min，100%兩次，每次30 min。包埋劑與丙酮混合液(1∶1)37℃浸透1 h，包埋劑與丙酮混合液(3∶1)浸透，37℃過夜;純包埋劑37℃浸透24 h后包埋，60℃聚合48 h。Leica UCT超薄切片機切片，日立H-7500透射電鏡觀察凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗及四格表確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠一般情況的變化 裸鼠成瘤前飲食、飲水及活動情況良好，四組間體重?zé)o差異。用藥后順鉑組裸鼠活動明顯減少，飲食量下降，體重下降，持續(xù)到實驗結(jié)束。對照組、恩度組、恩度聯(lián)合順鉑組裸鼠體重一直持續(xù)增長至實驗結(jié)束(表1)。實驗結(jié)束時，順鉑組裸鼠體重較其余各組裸鼠體重明顯減少(P＜0.05)，對照組與恩度組裸鼠體重之間比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.53)，但是恩度聯(lián)合順鉑組裸鼠體重分別與對照組和恩度組之間裸鼠體重比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 裸鼠體重量表(±s，n=8，g)

表1 裸鼠體重量表(±s，n=8，g)

組別 初始體重 結(jié)束體重恩度聯(lián)合順鉑組18.26±0.35 19.75±0.33恩度組 18.17±0.73 22.50±0.59順鉑組 17.99±0.41 14.21±0.83對照組18.62±0.74 21.98±0.91

2.2 裸鼠腫瘤體積的變化 四組裸鼠皮下移植瘤體積隨實驗進行逐漸增長，對照組體積增長迅速，而順鉑組、恩度組、恩度聯(lián)合順鉑組體積增長緩慢。實驗結(jié)束時，恩度聯(lián)合順鉑組、恩度組、順鉑組、對照組裸鼠體積依次為(0.29±0.13)、(0.52±0.29)、(0.60±0.31)、(1.29 ±0.65)cm3。各組腫瘤體積之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.032＜0.05)。其中，對照組分別與順鉑組、恩度組、恩度聯(lián)合順鉑組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而順鉑組、恩度組和恩度聯(lián)合順鉑組之間兩兩比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果表明恩度可以抑制裸鼠腫瘤的生長，但是沒有消瘤作用。

2.3 裸鼠腫瘤的質(zhì)量變化 實驗結(jié)束時，恩度聯(lián)合順鉑組、恩度組、順鉑組、對照組裸鼠腫瘤質(zhì)量依次為(0.43±0.25)、(0.84±0.33)、(0.79±0.26)、(1.81±0.75)g。對照組分別與順鉑組、恩度組和恩度聯(lián)合順鉑組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而順鉑組、恩度組和恩度聯(lián)合順鉑組之間兩兩比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 免疫組化結(jié)果 各組之間微血管密度的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)(圖1)，恩度組、恩度聯(lián)合順鉑組腫瘤血管的抑制作用較明顯，兩組MVD分別為11.38±1.25和10.93±1.54，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而分別與順鉑組(16.17±1.33)、對照組(23.73±2.40)MVD比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，順鉑組與對照組之間MVD比較也有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.5 RT-PCR檢測結(jié)果 與對照組相比，恩度組和恩度聯(lián)合順鉑組ID1和VEGF mRNA表達明顯降低(P＜0.05);而順鉑組和對照組之間ID1和VEGF mRNA表達沒有顯著性差異(P＞0.05)(圖2)。

2.6 Western印跡檢測結(jié)果 與對照組相比，恩度組和恩度聯(lián)合順鉑組ID1和VEGF蛋白表達量明顯降低(P＜0.05);而順鉑組和對照組之間ID1和VEGF蛋白表達量沒有顯著性差異(P＞0.05)。見圖3。

2.7 裸鼠腫瘤細胞超微結(jié)構(gòu)變化 在透射電鏡下觀察，恩度組和恩度聯(lián)合順鉑組的裸鼠腫瘤細胞均發(fā)現(xiàn)有凋亡細胞，表現(xiàn)為可見核碎裂塊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，有脫顆?，F(xiàn)象，線粒體髓樣化(圖4)。在對照組和順鉑組內(nèi)并未見到細胞凋亡情況，而是發(fā)現(xiàn)大量變性壞死的細胞，表現(xiàn)為線粒體大部分嵴消失，線粒體膜缺損，線粒體髓樣化，胞質(zhì)水腫有變性壞死，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴張，有脫顆?，F(xiàn)象(圖4)。結(jié)果顯示恩度不僅可以抑制腫瘤新生血管的生成，還通過促進腫瘤細胞凋亡而直接抑制部分腫瘤細胞的增殖，進而達到抑制腫瘤的作用。

圖1 各組微血管密度比較(胞質(zhì)中的棕色顆粒為高表達的CD34蛋白(×100)

3 討論

恩度是我國自主研發(fā)的多靶點抗腫瘤血管生成藥物。恩度大量的臨床前與臨床試驗肯定了恩度作為新型靶向抗腫瘤藥物的有效性與安全性〔5〕。恩度的優(yōu)勢有〔6～8〕:靶點直接暴露于血液中，便于藥物直接作用;靶點基因表達穩(wěn)定，不易產(chǎn)生抗藥性;無需考慮腫瘤組織學(xué)特異性;可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移;有下游放大效應(yīng);不良反應(yīng)相對較少。恩度與放、化療聯(lián)合具有協(xié)同作用:(1)可使腫瘤區(qū)血管生成正?；M織間高壓減輕，利于化療藥向腫瘤區(qū)輸送。(2)放、化療所致局部腫瘤區(qū)缺氧可促VEGF表達，幫助腫瘤細胞抵抗放、化療的凋亡誘導(dǎo)機制;而聯(lián)用恩度將預(yù)防此繼發(fā)保護效應(yīng)，使治療反應(yīng)增敏。

順鉑是細胞毒性藥物，抗腫瘤作用顯著〔9〕。本實驗中實驗各組均表現(xiàn)為瘤體減小，表明細胞殺傷與抑制血管生成均能夠抑制裸鼠胃癌種植瘤的生長;但實驗各組間比較無明顯差異，可能由于腫瘤生長時間以及藥物作用時間和濃度造成差異無顯著性。單用順鉑組的裸鼠體重下降非常明顯，裸鼠消瘦，而單用恩度組和恩度與順鉑聯(lián)合組的裸鼠體重是逐漸增長的，可見恩度可以降低化療藥引起的裸鼠體重下降等副作用。MVD免疫組化結(jié)果顯示，恩度與聯(lián)合組對MVD抑制效果明顯，順鉑組與對照組抑制效果明顯低于恩度與聯(lián)合組，表明恩度具有明顯的血管抑制效果。有文獻證實恩度對微血管密度的抑制作用是通過抑制VEGF上游因子ID1表達實現(xiàn)的，本研究結(jié)果顯示與上述理論相符，而順鉑對該因子的作用效果不顯著。透射電鏡結(jié)果顯示恩度作用發(fā)現(xiàn)后細胞凋亡現(xiàn)象;而在對照組和順鉑組內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)確實的凋亡現(xiàn)象，可以進一步認為恩度不僅可以抑制腫瘤新生血管的生成，還通過促進腫瘤細胞凋亡而直接抑制部分腫瘤細胞的增殖，進而達到抑制腫瘤的作用。

綜上所述，本試驗發(fā)現(xiàn)恩度可以通過降低ID1的表達抑制血管的新生，從而達到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的效果，為胃癌的新輔助化療提供了一種新的思路。

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