胡 林，翁永京，萬(wàn)小玲，黃麗紅

(四川泰華堂制藥有限公司，四川廣漢 618300)

藿香正氣膠囊微生物限度檢查法驗(yàn)證

胡 林，翁永京，萬(wàn)小玲，黃麗紅

(四川泰華堂制藥有限公司，四川廣漢 618300)

為建立藿香正氣膠囊微生物限度檢查驗(yàn)證方法，采用多種陽(yáng)性菌作為對(duì)照菌，采用回收率試驗(yàn)測(cè)定其抑菌成分對(duì)微生物限度檢查的影響.根據(jù)回收率試驗(yàn)結(jié)果，藿香正氣膠囊抑菌成分對(duì)微生物限度檢查影響較大，通過(guò)系統(tǒng)性設(shè)置試驗(yàn)，表明薄膜過(guò)濾法、離心沉淀薄膜過(guò)濾法能消除其影響，但薄膜過(guò)濾法中枯草芽孢桿菌回收率相對(duì)較低，抑菌成分消除不徹底，而離心沉淀集菌薄膜過(guò)濾法能完全、徹底消除其抑菌作用.

微生物限度檢查;抑菌成分;薄膜過(guò)濾;驗(yàn)證

0 引言

藿香正氣膠囊是一種具有解表化濕，理氣和中功效的，含有廣藿香、紫蘇葉、白芷、白術(shù)、陳皮、厚樸、茯苓、桔梗、甘草、大腹皮等成分的中成藥，常用于外感風(fēng)寒、內(nèi)傷濕滯、頭痛昏重、胸隔痞悶、脘腹脹痛和嘔吐泄瀉等癥的治療.由于本品為含有多種抑菌成分的中藥材制劑［1-17］，按《藥典》規(guī)定，含抑菌成分的中成藥的微生物限度檢查［20-21］必須在消除供試液抑菌活性后，再按規(guī)定的方法進(jìn)行檢查.同時(shí)，還需對(duì)所采用檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以確認(rèn)供試品的抑菌活性和保證測(cè)定方法的可靠性.據(jù)此，本研究對(duì)藿香正氣膠囊微生物限度檢查法進(jìn)行方法驗(yàn)證，以評(píng)價(jià)本品微生物限度檢查方法的可行性，規(guī)范微生物限度檢查方法，進(jìn)而提供產(chǎn)品質(zhì)量控制依據(jù).

1 儀器與材料

1.1 儀器

實(shí)驗(yàn)所用的儀器包括:生化培養(yǎng)箱、顯微鏡、立式電熱蒸汽消毒器、天平、ZF-1型紫外燈、電熱鼓風(fēng)干燥箱、恒溫水浴鍋、平皿(直徑90 mm)、接種針、振蕩器、酒精燈、離心機(jī)等.

1.2 樣品

實(shí)驗(yàn)所用的樣品為藿香正氣膠囊，由四川泰華堂制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)為，110201、110601、120301).

1.3 培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)中，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)，膽鹽乳糖培養(yǎng)基用于大腸埃希菌培養(yǎng).

1.4 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)所有菌株包括:大腸埃希菌 CMCC(B)(44102)、金黃色葡萄球菌CMCC(B)(26003)、枯草芽孢桿菌 CMCC(B)(63501)、白色念珠菌 CMCC(F)(98001)和黑曲霉CMCC(F)(98003)，所有菌株均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供.

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

按照文獻(xiàn)［20］中“細(xì)菌、霉菌及酵母菌項(xiàng)下計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”方法對(duì)本品進(jìn)行計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，同時(shí)參考國(guó)家藥典委員會(huì)網(wǎng)上公布之相關(guān)方法.

2.1.1 常規(guī)法.

為明確本品驗(yàn)證的過(guò)程，確保驗(yàn)證不受常規(guī)法分析的干擾，故做常規(guī)法的驗(yàn)證.

1)對(duì)照用菌液的制備.取經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌肉湯培養(yǎng)物1 mL，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液分別稀釋制成每1 mL中含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，備用.取經(jīng)25℃培養(yǎng)18～24 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋制成每1 mL中含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，備用.取經(jīng)20～25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗一下，用帶有棉花的球形吸管取出菌液至無(wú)菌試管內(nèi)，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1 mL中含孢子數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液，備用.

2)供試液的制備.無(wú)菌操作稱取供試品10 g，置入100 mL 40℃的pH值為7.0的無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液中，充分振搖后靜置，吸取上清液，作為1∶10的供試液.

3)回收率測(cè)定.

①試驗(yàn)組.取供試液1 mL，加入直徑為90 mm的無(wú)菌平皿中，同時(shí)加入50～100 cfu試驗(yàn)菌株，注入10～20 mL溫度不超過(guò)45℃的溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，記錄其菌數(shù)，測(cè)定回收率.

②供試品對(duì)照組.取供試液1 mL，加入直徑為90 mm的無(wú)菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng).每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板.

③活菌試驗(yàn)組.取50～100 cfu試驗(yàn)菌株加入無(wú)菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng).每個(gè)菌種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板.

④稀釋劑對(duì)照組.取稀釋劑1 mL，加入50～100 cfu試驗(yàn)菌株，注入10～20 mL溫度不超過(guò)45℃的溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，每個(gè)菌種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板.

4)結(jié)果.細(xì)菌培養(yǎng)48 h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù);霉菌、酵母菌培養(yǎng)72 h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)中所有枯草芽孢桿菌回收率均未達(dá)到70%，故考慮采用培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行驗(yàn)證.

2.1.2 培養(yǎng)基稀釋法.

1)對(duì)照用菌液和供試液的制備，同常規(guī)法.

2)回收率測(cè)定.

①試驗(yàn)組.分別取供試液0.2 mL，加入直徑為90 mm的無(wú)菌平皿中，同時(shí)加入50～100 cfu試驗(yàn)菌株，注入10～20 mL溫度不超過(guò)45℃的溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng).每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，記錄其菌數(shù)，測(cè)定回收率.

②供試品對(duì)照組.取供試液0.2 mL，加入直徑為90 mm的無(wú)菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng).每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板.

③活菌試驗(yàn)組.取50～100 cfu試驗(yàn)菌株加入無(wú)菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng).每個(gè)菌種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板.

④稀釋劑對(duì)照組.取稀釋液0.2 mL，加入50～100 cfu試驗(yàn)菌株，加入直徑為90 mm的無(wú)菌平皿中，按試驗(yàn)組方法操作全過(guò)程.每個(gè)菌種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板.

3)結(jié)果.細(xì)菌培養(yǎng)48 h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù);霉菌、酵母菌培養(yǎng)72 h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組枯草芽孢桿菌回收率仍未達(dá)到70%，故考慮采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行驗(yàn)證.

2.1.3 薄膜過(guò)濾法.

1)對(duì)照用菌液和供試液的制備，同常規(guī)法.

2)回收率試驗(yàn).

①試驗(yàn)組.取供試品原液1 mL，用pH值為7.0無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液50～100 mL稀釋后，混勻，加入薄膜過(guò)濾器中，過(guò)濾.用無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖冼，100 mL/次，每膜沖洗2次，在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu試驗(yàn)菌株，過(guò)濾后取膜貼于瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng).每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板，測(cè)定回收率.

②供試液對(duì)照組.取供試品原液1 mL，用pH值為7.0無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液50～100 mL稀釋后，混勻，加入薄膜過(guò)濾器中，過(guò)濾.用無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖冼，100 mL/次，每膜沖洗2次，過(guò)濾后取膜貼于瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng).每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板.

③活菌試驗(yàn)組.取50～100 cfu/mL試驗(yàn)菌株加加入無(wú)菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng).每個(gè)菌種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板.

④稀釋劑對(duì)照組.取緩沖液100 mL和50～100 cfu試驗(yàn)菌株加入薄膜過(guò)濾器中，過(guò)濾，后取膜貼于瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng).每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平板.

⑤培養(yǎng)和計(jì)數(shù).細(xì)菌培養(yǎng)48 h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，一般以48 h的菌落數(shù)報(bào)告;霉菌、酵母菌培養(yǎng)72 h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，一般以72 h的菌落數(shù)報(bào)告.點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌落報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌落.

3)結(jié)果.細(xì)菌培養(yǎng)48 h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù);霉菌、酵母菌培養(yǎng)72 h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù).結(jié)果見(jiàn)表1、表2.

表1、2結(jié)果表明，以上各次實(shí)驗(yàn)回收率均在70%以上，表2結(jié)果表明，以上各次實(shí)驗(yàn)回收率均在70%以上，可采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行驗(yàn)證.但該方法中枯草芽孢桿菌回收率有待進(jìn)一步提升.為保證徹底消除產(chǎn)品中抑菌成分，同時(shí)保證回收率實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定、可行，故考慮采用離心沉淀集菌薄膜過(guò)濾法進(jìn)行驗(yàn)證.2.1.4 離心沉淀集菌薄膜過(guò)濾法.

1)對(duì)照用菌液和供試液的制備，同常規(guī)法.

表1 薄膜過(guò)濾法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(試驗(yàn)組菌回收率)結(jié)果表

表2 薄膜過(guò)濾法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(稀釋劑對(duì)照組菌回收率)結(jié)果表

2)回收率測(cè)定.

①試驗(yàn)組.吸取供試液10 mL，于已滅菌的具塞離心管內(nèi)，以500 r/min離心5 min，取上清液1 mL，用pH值為7.0無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液100 mL稀釋，混勻.加入薄膜過(guò)濾器中，過(guò)濾.用 pH值為7.0無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖洗，100 mL/次，分別試驗(yàn)，每膜沖洗3次和5次，在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu試驗(yàn)菌株，過(guò)濾后取膜貼于瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng).每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板，測(cè)定回收率.

②供試品對(duì)照組.取供試液1 mL，用pH值7.0無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液100 mL稀釋，混勻.加入薄膜過(guò)濾器中，過(guò)濾.沖冼液100 mL/次，分別實(shí)驗(yàn)，每膜沖洗3次和5次，過(guò)濾后取膜貼于瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng).每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板.

③活菌試驗(yàn)組.取50～100 cfu試驗(yàn)菌株加入無(wú)菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng).每個(gè)菌種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板.

④稀釋劑對(duì)照組.取試驗(yàn)用稀釋液10 mL，按試驗(yàn)組供試液制備方法操作全過(guò)程.每個(gè)菌種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板.

3)結(jié)果.細(xì)菌培養(yǎng)48 h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù);霉菌、酵母菌培養(yǎng)72 h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù).結(jié)果見(jiàn)表3～表6.

表3 離心沉淀集菌薄膜過(guò)濾法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(試驗(yàn)組菌回收率試驗(yàn))結(jié)果表(沖洗液300 mL/膜;n=3)

表4 離心沉淀集菌薄膜過(guò)濾法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(稀釋劑對(duì)照組菌回收率試驗(yàn))結(jié)果表(沖洗液300 mL/膜)

表5 離心沉淀集菌薄膜過(guò)濾法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(試驗(yàn)組菌回收率試驗(yàn))結(jié)果表(沖洗液500 mL/膜;n=3)

表6 離心沉淀集菌薄膜過(guò)濾法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(稀釋劑對(duì)照組菌回收率試驗(yàn))結(jié)果表(沖洗液500 mL/膜)

表3～6結(jié)果表明，以上各次實(shí)驗(yàn)回收率均在80%以上.

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明，薄膜過(guò)濾法對(duì)照菌的回收率均雖然達(dá)到70%以上，但該實(shí)驗(yàn)方法中枯草芽孢桿菌回收率相對(duì)較低，抑菌成分消除不徹底.離心沉淀集菌薄膜過(guò)濾法對(duì)照菌的回收率均達(dá)到80%以上，徹底消除了抑菌成分.同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，該法隨著沖洗量的增加，測(cè)定對(duì)照菌的回收率反而有下降的趨勢(shì)，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中易出現(xiàn)濾膜破損等情況，故選擇沖洗液沖洗量為300 mL/膜的離心沉淀集菌薄膜過(guò)濾法.

2.2 控制菌檢查法的驗(yàn)證

按照文獻(xiàn)［20］中“控制菌檢查法的驗(yàn)證”進(jìn)行驗(yàn)證.

2.2.1 供試液的制備.

無(wú)菌操作稱取供試品10 g，置入100 mL 40℃的pH值為7.0無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液中，充分振搖，靜置，吸取上清液，作為1∶10的供試液.

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).

1)試驗(yàn)組.取供試液10 mL至緩沖液100 mL中，混勻.加入薄膜過(guò)濾器中，用無(wú)菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖冼，100 mL/次，每膜沖洗2次，在最后一次沖洗液中加入10～100 cfu試驗(yàn)菌株，過(guò)濾后取膜加入增菌培養(yǎng)基中，按照相應(yīng)控制菌檢查法檢查.

2)陰性菌對(duì)照組.取10～100 cfu金黃色葡萄球菌加入增菌培養(yǎng)基中，按照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為大腸埃希菌陰性對(duì)照.

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示.

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表(n=3)

表7數(shù)據(jù)表明，以上各次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的控制菌檢查方法專屬性較強(qiáng)、方法可行.

3 討論

中藥成分復(fù)雜，許多成分都有不同程度的抑菌作用，因而有必要根據(jù)各個(gè)品種、各個(gè)企業(yè)具體生產(chǎn)工藝，通過(guò)不同方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確立適宜的微生物限度檢驗(yàn)方法.

本研究中的藿香正氣膠囊，其藥材品種較多，各藥材抑菌成分復(fù)雜，且相互交替影響，故對(duì)微生物限度驗(yàn)證方法的選用具有典型意義.

本研究對(duì)藿香正氣膠囊制劑生產(chǎn)過(guò)程中使用醇沉工藝、大孔樹(shù)脂工藝的品種的微生物驗(yàn)證做了初步的研究，驗(yàn)證了薄膜過(guò)濾法、離心沉淀集菌薄膜過(guò)濾法等方法.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，離心沉淀集菌薄膜過(guò)濾法以低速500 r/min離心，再以高速3 000 r/min離心集菌較為適宜，沖洗量達(dá)到300 mL時(shí)可消除抑菌作用，但隨著沖洗量增加，易出現(xiàn)濾膜破損等不易控制情況.

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Validation of Microbial Limit Test of Huoxiangzhengqi Capsule

HU Lin，WENG Yongjin，WANG Xiaoling，HUANG Lihong
(Sichuan Taihuatang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guanghan 618300，China)

A variety of Gram-positive bacteria are used as the control bacteria.The recovery test determines the impact of antifungal composition on microbial limit tests.According to the results of the recovery test，Huoxiangzhengqi capsule antifungal composition has great effect on the microbial limit test.Through the systematic set to test，the results show that the membrane filtration，centrifugation and membrane filtration method can eliminate its influence.But in the membrane filtration method，bacillus subtilis recovery rate is relatively low and antibacterial ingredients can＇t be eliminated thoroughly.The centrifugal sedimentation and membrane filtration method can eliminate the antimicrobial effect completely and thoroughly.

microbial limit test;antifungal composition;membrane filtration;verification

R284

A

1004-5422(2013)03-0224-05

2013-07-05.

胡 林(1974—)，男，工程師，從事中藥新制劑研究.