任潤(rùn)珍，馬 銘，李長(zhǎng)天，劉 潤(rùn)，李應(yīng)東，吳建軍

（1.舟曲婦幼保健站，甘肅 舟曲 734300；2.蘭州市城關(guān)區(qū)婦幼保健所，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

許多原因如缺血、缺氧等都會(huì)導(dǎo)致心臟器質(zhì)性功能損害，從而導(dǎo)致心功能下降。心臟器質(zhì)性功能損害主要由心肌細(xì)胞凋亡引起，心肌細(xì)胞凋亡為細(xì)胞內(nèi)程序性死亡，由于心肌細(xì)胞的不可再生性，如何抑制心肌細(xì)胞凋亡也因此成為研究熱點(diǎn)。在許多研究中都證實(shí)[1-2]生脈不僅可以預(yù)防和減輕心肌缺血癥狀，而且可以限制缺血引起的心肌頓抑，促進(jìn)再灌注期心功能恢復(fù)，縮小心肌梗死面積。硒是維持人體正常生理功能和生化代謝所必需的微量元素，硒在心血管疾病中的作用已為很多研究肯定，本研究用生脈散與硒麥芽提取物的混合制劑（生脈硒）對(duì)大鼠急性缺氧-復(fù)氧造成的心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用及機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生2～3天Wistar大鼠，雌雄不限，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

小牛血清購(gòu)于蘭州生物制品研究所，DMEM培養(yǎng)基干粉為Gibco公司產(chǎn)品，PCR-ELISA端粒酶檢測(cè)試劑盒（TRA Peze ELISA Telomerase Detection Kit）為美國(guó)Intergen公司產(chǎn)品，胰蛋白酶由美國(guó)GTBCO公司提供，生脈注射液購(gòu)自雅安三九藥業(yè)有限公司（批號(hào)為101125），富硒麥芽（北京市食品工業(yè)研究所，衛(wèi)新食準(zhǔn)字第1號(hào)），硒麥芽用75%乙醇反復(fù)提取3次，兩者混合制備成生脈硒[3]，使硒的含量為0.21～0.34mg/ml。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng)和缺血模型建立

結(jié)合Laarse等[4-5]方法，在無(wú)菌條件下取出生后45～72小時(shí)SD乳鼠心肌細(xì)胞，用0.06%胰蛋白酶消化，制成濃度為105個(gè)/ml的心肌細(xì)胞懸液，測(cè)細(xì)胞存活率大于95%，將培養(yǎng)瓶置入5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24小時(shí)更換培養(yǎng)液（含20%小牛血清+DMEM液），培養(yǎng)72小時(shí)后。采用化學(xué)缺氧法，使用氧清除劑連二亞硫酸鈉（Na2S2）建立缺氧模型，將正常的細(xì)胞培養(yǎng)液換成缺氧液，CO2培養(yǎng)箱中孵育5分鐘，造成細(xì)胞缺氧。再將缺氧液換成正常培養(yǎng)液孵育5分鐘模擬再給氧，之后立即收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.4 給藥及實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為兩組：（1）空白對(duì)照組：心肌細(xì)胞不做任何處理，按正常條件培養(yǎng)；（2）缺氧組：采用化學(xué)缺氧法，使用氧清除劑連二亞硫酸鈉（Na2S2）建立缺氧模型；（3）生脈硒組：生脈硒組處理正常心肌細(xì)胞，在培養(yǎng)液中加入5ml/L的生脈硒（生脈硒原液為淡黃色，5ml/L濃度不會(huì)因藥液顏色對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響）；（4）生脈硒+缺氧組：于缺氧之前24小時(shí)加入5ml/L的生脈硒，缺氧同時(shí)亦在培養(yǎng)液中加入5ml/L的生脈硒（生脈硒原液為淡黃色，5ml/L濃度不會(huì)因藥液顏色對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響）。

1.5 檢測(cè)不同處理對(duì)凋亡心肌細(xì)胞端粒酶活性的影響

細(xì)胞以1×105個(gè)/ml濃度接種于直徑3.5cm培養(yǎng)皿，24小時(shí)后按照以上各組分別處理，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，收集細(xì)胞，抽提端粒酶。按美國(guó)Intergen公司端粒酶檢測(cè)試劑盒（TRA Peze ELISA Telomerase Detection Kit）說(shuō)明的方法檢測(cè)端粒酶活性。樣品在TRAP反應(yīng)時(shí)蛋白定量為1 μg，設(shè)端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)照組和樣本加熱滅活端粒酶陰性對(duì)照組。

1.6 不同處理對(duì)凋亡心肌細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞周期的影響

取200ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下，用含10%小牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液，給予不同處理。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)收集培養(yǎng)液離心（1000轉(zhuǎn)/分），棄上清液，留細(xì)胞沉淀待用。消化各組培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組一一對(duì)應(yīng)，與培養(yǎng)液中收集的細(xì)胞沉淀混合，再離心（1000轉(zhuǎn)/分），棄上清液。用PBS液輕輕吹洗，離心（1000轉(zhuǎn)/分），棄上清液大部，細(xì)胞懸液緩慢分散加入到0.7ml、20℃的無(wú)水乙醇固定液中。重復(fù)操作，加入同一細(xì)胞固定管中分散細(xì)胞。然后用70%的冷乙醇充分清洗細(xì)胞懸液制樣管中的殘留細(xì)胞并加入分散液中，最終保持乙醇濃度約為70%。測(cè)定時(shí)1000rpm離心5min，棄上清液，用冷PBS液洗一遍，1000rpm離心，棄上清液。加入含有RNase（50mg/L）的PI（50mg/L）溶液0.5ml（細(xì)胞濃度>1×106/ml），室溫下避光置30 min。用200目細(xì)胞篩過(guò)濾后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，吸收波長(zhǎng)600nm）。用計(jì)算機(jī)自帶 Multicycle（Phoenix Flow System，San Diego，CA，USA）軟件分析，計(jì)算凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及細(xì)胞周期百分?jǐn)?shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同處理對(duì)缺氧心肌細(xì)胞端粒酶活性的影響

結(jié)果可見(jiàn)，生脈硒組、生脈硒+缺氧組對(duì)凋亡心肌細(xì)胞端粒酶活性與缺氧組比較，活性較高（P<0.05），其中空白對(duì)照與缺氧組對(duì)端粒酶活性的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 不同處理對(duì)凋亡心肌細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞周期的影響

結(jié)果可見(jiàn)，生脈散組、硒麥芽組、生脈硒處理組對(duì)凋亡心肌細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

表1 不同處理對(duì)凋亡心肌細(xì)胞端粒酶活性的影響（±s）

表1 不同處理對(duì)凋亡心肌細(xì)胞端粒酶活性的影響（±s）

注：a與缺氧組比較 P＜0．05，b與空白對(duì)照組比較 P＜0．01，cP＜0．05

空白對(duì)照組缺氧組生脈硒組生脈硒+缺氧組組別 動(dòng)物數(shù) 端粒酶活性（A450）6126120．912±0．233b 0．265±0．127c 0．836±0．203a 0．661±0．188ac

表2 不同處理對(duì)凋亡心肌細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞周期的影響（me a n±S D）

3 討論

本研究采用體外缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，觀察生脈硒對(duì)缺氧后心肌細(xì)胞凋亡作用并初步探討了其作用機(jī)制。生脈注射液含有紅參、麥冬、五味子，三藥相合，一補(bǔ)一清一斂，具有益氣養(yǎng)陰、生津止渴、斂陰止汗之功，使氣復(fù)津回、汗止而陰存。有關(guān)生脈的基礎(chǔ)研究和臨床研究文獻(xiàn)較多[6-7]。臨床上常見(jiàn)生脈與其他藥物如天麻素、葛根芩、燈盞花素等聯(lián)合使用提高療效的報(bào)道[8-10]?！拔北粐?guó)內(nèi)外醫(yī)藥界和營(yíng)養(yǎng)學(xué)界尊稱為“長(zhǎng)壽元素”、“抗癌之王”、“心臟守護(hù)神”。硒對(duì)人類健康的巨大作用是其他物質(zhì)無(wú)法替代的。缺硒會(huì)直接導(dǎo)致人體免疫能力下降，臨床醫(yī)學(xué)證明，威脅人類健康和生命的40多種疾病都與人體缺硒有關(guān)[11-13]。生脈與硒聯(lián)合作用研究還不多見(jiàn)。1985年Greider等[14]首次發(fā)現(xiàn)了端粒酶，端粒酶合成DNA末端的重復(fù)結(jié)構(gòu)以補(bǔ)償細(xì)胞分裂時(shí)端粒的縮短，維持其長(zhǎng)度，保持細(xì)胞內(nèi)DNA的動(dòng)態(tài)平衡，從而防止細(xì)胞的凋亡。心臟器質(zhì)性功能的損害主要原因是心肌細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞凋亡與端粒酶活性息息相關(guān)，端粒酶的活性部分反映了細(xì)胞自我修復(fù)的能力。以前的研究主要集中在生脈散和硒對(duì)心肌細(xì)胞線粒體、自由基等的研究，對(duì)端粒酶的報(bào)道較少。本研究顯示，生脈硒對(duì)缺氧心肌細(xì)胞端粒酶的活性有明顯的提高作用，顯示了生脈與硒聯(lián)合對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)際上從本研究組后期生脈硒對(duì)凋亡心肌細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期的影響進(jìn)一步佐證了它們的保護(hù)作用。

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