孫 紅， 王昌祿， 李貞景， 楊朝暉， 崔海燕， 陳勉華， 王玉榮

(天津科技大學食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津 300457)

黑曲霉M8固態(tài)發(fā)酵槐米對高尿酸血癥小鼠的影響

孫 紅， 王昌祿*， 李貞景， 楊朝暉， 崔海燕， 陳勉華， 王玉榮

(天津科技大學食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津 300457)

以槐米為原料進行黑曲霉固態(tài)發(fā)酵，HPLC法測定槐米發(fā)酵前后槲皮素質(zhì)量分數(shù)變化，研究了槐米發(fā)酵物對高尿酸血癥小鼠的血尿酸(SUA)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平的影響.結(jié)果表明:經(jīng)黑曲霉M8菌株固態(tài)發(fā)酵后，槐米中有95.62%的蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素，槲皮素質(zhì)量分數(shù)由發(fā)酵前3.28 mg/g提高到39.23 mg/g，是發(fā)酵前的11.96倍.槐米發(fā)酵物高劑量組(400 mg/kg)和低劑量組(200 mg/kg)可分別使高尿酸小鼠SUA值降低24.37%，17.96%，與模型組相比，有顯著性差異(P＜0.05);而未發(fā)酵的槐米組(400 mg/kg)僅使小鼠SUA值降低2.23%，與模型組相比，無顯著性差異(P＞0.05)，表明黑曲霉發(fā)酵槐米的降尿酸作用效果優(yōu)于未發(fā)酵槐米.此外，槐米發(fā)酵物能顯著降低高尿酸血癥模型小鼠BUN、SCr值(P＜0.05)，可減輕造模藥物對小鼠腎功能的損傷.急性毒理實驗證明，槐米黑曲霉發(fā)酵物安全.

槐米;黑曲霉;固態(tài)發(fā)酵;槲皮素;高尿酸血癥

*王昌祿，男，教授，博士生導師，主要從事食品生物技術方面的研究.通訊作者.

槐米(Flos Sophorae)，別名白槐、槐花米、槐子，為豆科植物槐(sophorae japonical)的花蕾，是藥食同源的保健佳品［1］，具有涼血止血、清肝瀉火的功效.槐米中含有蘆丁(rutin)、鞣質(zhì)、植物甾類、槐米花甲素、槐米花乙素、槐米花丙素等成分［2－3］.其中，蘆丁(又名蕓香苷)為主要功能性成分，臨床用于治療燒傷、關節(jié)炎及各種血管疾病.槲皮素(quercetin)是蘆丁的水解產(chǎn)物，具有抗炎、抗氧化、凋亡誘導、抗癌等多種生物學活性［4－8］.此外，姚芳芳等［9］研究表明，槲皮素能顯著降低高尿酸血癥大鼠的血清尿酸水平.

研究表明，蘆丁進入腸道后，可被腸道微生物所產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶和α-鼠李糖苷酶水解為槲皮素而發(fā)揮藥效.傳統(tǒng)常采用酸水解方法從蘆丁中制備槲皮素，該方法槲皮素得率偏低，酸用量大，對環(huán)境有一定影響.Andlauer等［10］通過某些微生物的轉(zhuǎn)化，可使槐米中的蘆丁轉(zhuǎn)化為槲皮素.黑曲霉是重要的工業(yè)發(fā)酵菌種［11］，能利用槐米中的氨基酸、微量元素等營養(yǎng)元素生長繁殖，產(chǎn)生糖苷酶將苷降解成苷元.

高尿酸血癥(hyperuricemia)是一種嘌呤代謝障礙疾病，體內(nèi)的嘌呤底物經(jīng)過黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)催化作用形成尿酸，傳統(tǒng)的降尿酸藥物如別嘌呤醇、丙磺舒、苯溴馬隆等毒副作用明顯，對肝腎等功能有一定程度的損害［12－13］，很多學者開始從中草藥中尋找低毒高效的高尿酸血癥治療藥物.

本研究將以傳統(tǒng)中草藥——槐米為原料，通過黑曲霉M8固態(tài)發(fā)酵，使蘆丁轉(zhuǎn)化成槲皮素.利用槐米發(fā)酵物對氧嗪酸鉀建模的高尿酸血癥小鼠進行灌胃實驗，研究槐米發(fā)酵物對高尿酸血癥小鼠血尿酸(serum uric acid，SUA)、尿素氮值(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，SCr)水平的影響，通過急性毒理試驗檢驗槐米發(fā)酵物的安全性，為將其開發(fā)成降尿酸功能性產(chǎn)品提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 發(fā)酵菌種

菌種為天津科技大學實驗室保藏的黑曲霉菌種，編號M8.

1.1.2 材料與試劑

槐米，安徽省亳州市永剛飲片有限公司;蘆丁標準品(≥99%)，中國藥品生物制品檢定所;槲皮素標準品(≥98%)，上海源葉生物科技有限公司;別嘌呤醇片，廣東彼迪藥業(yè)有限公司;氧嗪酸鉀，上海生工生物工程技術服務有限公司;尿酸(SUA)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)試劑盒，南京建成生物工程研究所.

1.1.3 實驗動物

實驗用清潔級雄性ICR品系小鼠，質(zhì)量為30±5 g，由中國軍事醫(yī)學科學院提供，合格證號:SCXK－(軍)2007－006.

1.1.4 實驗儀器

HOG－S36型恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司;1200型高效液相色譜儀(配有紫外檢測器、熒光檢測器和B.04.03.SP 187色譜工作站)，美國 Agilent Technologies公司;J－26 XP型高速冷凍離心機，美國Beckman Coulte公司;DGG－101－2B型電熱鼓風干燥箱，天津市天宇實驗儀器有限公司;Mulitiskan Spectrum 1500型全波長酶標儀，美國Thermo公司.

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵實驗

將槐米粉碎后過100目篩，利用黑曲霉M8進行固態(tài)發(fā)酵.通過單因素條件優(yōu)化，確定發(fā)酵條件為:在250 mL三角瓶中加5.0 g槐米粉，20 mL察氏培養(yǎng)基無機鹽混合溶液，4 mL黑曲霉M8懸浮液，30℃，180 r/min 搖床條件下培養(yǎng) 7 d［14］.

1.2.2 槲皮素與蘆丁質(zhì)量分數(shù)的測定

色譜柱:Hypersil ODS2(4.6 mm ×250 mm，5 μm);柱溫:25℃;流動相:甲醇－水(60∶40)，磷酸(色譜純)調(diào) pH 值至 3.5;流速:1 mL/min［15］;檢測器:紫外檢測器;檢測波長:365 nm;進樣量:20 μL.

分別配制質(zhì)量濃度為 5，10，15，20，25 μg/mL 蘆丁、槲皮素標準品溶液，以質(zhì)量濃度(Y)對峰面積(X)進行回歸計算.

式中:A1為發(fā)酵前蘆丁質(zhì)量分數(shù)，mg/g;A2為發(fā)酵后蘆丁質(zhì)量分數(shù)，mg/g.

1.2.3 動物實驗

分別將黑曲霉發(fā)酵后的槐米樣品和未經(jīng)過發(fā)酵的槐米樣品干燥后粉碎，過100目篩，以0.5%CMC-Na為溶劑，配制槐米組、槐米發(fā)酵物低劑量組和槐米發(fā)酵物高劑量組的灌胃樣品.

將48只質(zhì)量為30±5 g的ICR品系清潔級雄性小鼠隨機分為6組，每組8只，分別設為正常組、模型組、別嘌呤醇組、發(fā)酵物高劑量組、發(fā)酵物低劑量組、槐米組.正常組(0.5%的CMC-Na 0.3 mL/d)，模型組(氧嗪酸鉀250 mg/(kg·d))，別嘌呤醇組(別嘌呤醇 40 mg/(kg·d))，發(fā)酵物低劑量組(200 mg/(kg·d))，發(fā)酵物高劑量組(400 mg/(kg·d))，槐米組(400 mg/(kg·d)).將小鼠在動物房適應性喂養(yǎng)7 d，從第8 d開始對小鼠進行灌胃實驗［16］.每天上午9點進行灌胃，灌胃前0.5 h禁水、禁食.采用氧嗪酸鉀建模法，除正常組(0.5%的CMC-Na 0.3 mL/d)外，每組按照氧嗪酸鉀250 mg/(kg·d)的劑量給藥建模.氧嗪酸鉀給藥0.5 h后，按照上述各組實驗規(guī)定的劑量給藥，連續(xù)灌胃7 d.

1.2.4 小鼠取血與生理指標檢驗

在最后1 d灌胃2 h后，采用眼球取血法取血，然后將小鼠斷頸處死.將收集的血液在4℃條件下，以3 500 r/min離心10 min，取上清液.將上清液在4℃條件下以3 500 r/min再次離心10 min，取上清液，置－20℃冰箱保藏，備用.按照試劑盒說明書方法測定SUA、BUN及SCr水平.

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁和槲皮素質(zhì)量分數(shù)的測定結(jié)果

采用HPLC法測定槐米發(fā)酵前后蘆丁和槲皮素質(zhì)量分數(shù)的變化.其結(jié)果如圖1(a)、(b).

根據(jù)蘆丁和槲皮素標準品液相色譜測定結(jié)果，蘆丁、槲皮素標準品的出峰時間分別在3.1 min和5.3 min左右.

由圖1(a)、(b)可以看出:黑曲霉發(fā)酵槐米樣品中第一個峰的保留時間為3.1 min左右，第二個峰的保留時間為5.3 min左右.出峰時間分別與蘆丁、槲皮素標準品出峰時間一致，可以確定這兩種物質(zhì)分別為蘆丁和槲皮素.

分別以蘆丁和槲皮素的質(zhì)量濃度(Y)對峰面積(X)作回歸計算，結(jié)果表明:在5～25 μg/mL范圍內(nèi)，蘆丁和槲皮素均有著良好的線性關系，回歸方程分別為Y=0.075 9X－1.983 9，R2=0.999 9;Y=0.023 6X+0.447 9，R2=0.999 7.根據(jù)蘆丁和槲皮素的線性方程，計算出槐米黑曲霉發(fā)酵物中蘆丁和槲皮素的質(zhì)量分數(shù).槐米發(fā)酵前后蘆丁和槲皮素質(zhì)量分數(shù)變化見圖2.

圖1 槐米經(jīng)黑曲霉發(fā)酵前、發(fā)酵后HPLC圖Fig.1 HPLC of Flos Sophorae before and after being fermented by Aspergillus niger

圖2 槐米發(fā)酵前后蘆丁、槲皮素質(zhì)量分數(shù)變化Fig.2 Mass fraction changes of rutin and quercetin of Flos Sophorae

由圖2可以看出，黑曲霉M8固態(tài)發(fā)酵槐米前，樣品中蘆丁的質(zhì)量分數(shù)較高，槲皮素的質(zhì)量分數(shù)較低，根據(jù)蘆丁和槲皮素的線性回歸方程計算得出，蘆丁和槲皮素的質(zhì)量分數(shù)分別為88.27 mg/g和3.28 mg/g;經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，槐米樣品中蘆丁的質(zhì)量分數(shù)降低為3.87 mg/g，槲皮素的質(zhì)量分數(shù)則明顯升高，達到39.23 mg/g，是發(fā)酵前槲皮素的11.96倍.槐米經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，有95.62%的蘆丁被轉(zhuǎn)化為槲皮素.研究表明，微生物利用槐米中的氨基酸、蛋白質(zhì)、微量元素等多種營養(yǎng)成分生長繁殖，并產(chǎn)生糖苷酶將苷降解生成苷元［17］.本實驗結(jié)果證明，經(jīng)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵，槐米中的大部分蘆丁被轉(zhuǎn)化成槲皮素.這很可能是由于黑曲霉在生長過程中產(chǎn)生糖苷酶，將蘆丁水解為槲皮素，提高了槐米發(fā)酵物中槲皮素的質(zhì)量分數(shù).

2.2 動物實驗結(jié)果

采用SPSS Statistics 17.0軟件進行單因素方差分析，結(jié)果以±S表示.組間兩兩比較采用LSD(L)和S－N－K(S)檢驗.檢驗水平 α=0.05;α=0.01.槐米發(fā)酵物對高尿酸血癥小鼠的SUA、BUN、SCr水平的影響結(jié)果見表1.

表1 高尿酸血癥小鼠SUA、BUN、SCr的測定結(jié)果Tab.1 Results of SUA、BUN、SCr in hyperuricemia mice

由表1可知，經(jīng)氧嗪酸鉀(250 mg/kg)灌胃7 d后，模型組SUA值均明顯升高，與正常組的SUA值相比有極顯著性差異(P＜0.01)，說明小鼠高尿酸血癥模型建模成功.

由表1可知，槐米發(fā)酵物高劑量組的SUA值(29.52±3.91 mg/L)與模型組(39.03±4.68 mg/L)有極顯著差異(P＜0.01);槐米發(fā)酵物低劑量組(32.02±4.44 mg/L)與模型組有顯著性差異(P＜0.05);而槐米組SUA值(38.16±5.20 mg/L)與模型組相比無顯著性差異(P＞0.05).槐米發(fā)酵物高、低劑量組分別使高尿酸小鼠的 SUA值降低24.37%、17.96%，而槐米組僅使其 SUA值降低2.23%.說明槐米發(fā)酵物能顯著降低高尿酸血癥小鼠SUA值，作用效果優(yōu)于未經(jīng)過發(fā)酵的槐米.

SCr和BUN是檢測腎功能的基本指標.與正常組相比，模型組SCr、BUN值均有升高，有極顯著差異(P＜0.01)，說明造模藥物會對小鼠腎功能造成一定程度損害.槐米發(fā)酵物高、低劑量組的SCr、BUN值與模型組相比均有極顯著性差異(P＜0.01)，與正常組相比，無顯著性差異(P＞0.05)，說明槐米發(fā)酵物高、低劑量組對氧嗪酸鉀造成的腎功能損傷具有一定的保護作用.

Mo等［18］研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)能夠降低氧嗪酸鉀所致高尿酸血癥小鼠的血清尿酸水平.本實驗結(jié)果表明，槐米經(jīng)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后，發(fā)酵物能夠有效的降低高尿酸血癥小鼠的SUA、BUN、SCr水平.這可能是因為經(jīng)過黑曲霉固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵物中槲皮素的質(zhì)量分數(shù)明顯增多，槲皮素通過抑制黃嘌呤氧化酶(XO)的活性，減少高尿酸血癥小鼠體內(nèi)尿酸的形成，從而降低小鼠的SUA、BUN、SCr水平.此外，槲皮素還具有一定的抗氧化作用，能夠清除體內(nèi)的自由基，這對降低高尿酸血癥小鼠SUA、BUN、SCr水平有一定的作用.

2.3 急性毒理實驗結(jié)果

急性毒理實驗主要是探究化學物的致死劑量，以初步評估其對人類可能造成毒害的危險性.它是一次性投入較大劑量后觀察動物的變化，觀察期大約為1周，判定動物的致死量(LD)和半致死量(LD50).

GB/T 15193.3—2003規(guī)定，如果投藥量大于5 000 mg/kg，無死亡，可以認為該品毒性較低，無需再做致死量精確測定［19］.對小鼠進行一次性灌胃侵染實驗后，每2 d觀察一次小鼠的活動狀況.小鼠灌胃后的活動狀況見表2.

表2 小鼠活動狀況Tab.2 Activity status of mice

實驗結(jié)果表明，經(jīng)一次性大劑量灌胃侵染后，各組小鼠的表現(xiàn)無明顯差異，均能進行正?；顒?

每周稱取各組小鼠的體重，各組小鼠體重取平均值.小鼠體重變化情況見圖3.

圖3 小鼠體重的變化情況Fig.3 Change of weight of mice

由圖3可知，各實驗組和正常組小鼠的體重有增加，無顯著性差異(P＞0.05)，說明槐米黑曲霉發(fā)酵物對小鼠體重無影響.根據(jù)小鼠經(jīng)一次性大劑量灌胃侵染實驗后的活性情況和體重變化，按照GB/T 15193.3—2003規(guī)定，可認為槐米黑曲霉發(fā)酵物安全.

3 結(jié)論

本研究對黑曲霉固態(tài)發(fā)酵前后，槐米中蘆丁和槲皮素的質(zhì)量分數(shù)變化進行了研究，結(jié)果表明:經(jīng)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵，槐米中的蘆丁被水解為槲皮素，槲皮素的質(zhì)量分數(shù)達到39.23 mg/g，是發(fā)酵前的11.96倍.進一步研究槐米發(fā)酵物對高尿酸血癥小鼠的影響，結(jié)果表明:槐米發(fā)酵物高、低劑量組均能顯著降低高尿酸血癥小鼠的SUA值(P＜0.05)，而未經(jīng)發(fā)酵的槐米組則不能顯著降低高尿酸血癥小鼠SUA值.同時，槐米發(fā)酵物高、低劑量組能極顯著降低高尿素血癥小鼠BUN、SCr(P＜0.01)，減輕氧嗪酸鉀造成的腎功能損傷.因此，槐米經(jīng)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵后，對高尿酸血癥小鼠的作用效果優(yōu)于未經(jīng)過發(fā)酵的槐米.同時，急性毒理實驗證明，大劑量的槐米黑曲霉固態(tài)發(fā)酵物對小鼠的活動狀態(tài)和體重均無明顯影響，可認為槐米發(fā)酵物安全.

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Effects of Flos Sophorae’s Solid-state Fermention by Aspergillus niger M8 on Hyperuricemia Mice

SUN Hong， WANG Chang-lu*， LI Zhen-jing， YANG Zhao-hui， CUI Hai-yan，CHEN Mian-hua，WANG Yu-rong
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin300457，China)

Flos Sophorawas used as a raw material for solid-state fermentation byAspergillus nigerM8，and changes of quercetin contents inFlos Sophorabefore and after being fermented were tested by HPLC.The results showed that after solid-state fermentation ofFlos SophorabyAspergillus nigerM8，most of the rutin(95.62%)was transformed to quercetin and the quercetin content was increased from 3.28 mg/g to 39.23 mg/g，which was 11.96 times higher than unfermentedFlos Sophora.The serum uric acid(SUA)content of mice treated by different doses(400 mg/kg and 200 mg/kg)of fermentedFlos Sophorawas decreased 24.37%and 17.96%，which was significantly(P＜0.05)lower than that in the model group.However，the SUA content of mice treated by the high does of unfermentedFlos Sophora(400 mg/kg)was only 2.23%lower than that of the control group.The results demonstrated that the solid-state fermentation byAspergillus nigerM8 could improve the reducing-SUA activity ofFlos Sophora.Moreover，the blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(SCr)contents in fermentedFlos Sophoratreatment groups were significantly(P＜0.05)lower than these in the model group，which indicated that fermentedFlos Sophoracould reduce the injury of drugs on mice kidneys.In addition，the safety of the product was tested by the acute toxicological experiment.

Flos Sophorae;Aspergillus niger;solid-state fermentation;quercetin;hyperuricemia

編者按:天然食品中含有多種具有生物活性的功能保健成分，是近年來食品科學研究的熱點領域之一.“黑曲霉M8固態(tài)發(fā)酵槐米對高尿酸血癥小鼠的影響”一文，研究了以槐米為原料進行黑曲霉固態(tài)發(fā)酵使蘆丁轉(zhuǎn)化成槲皮素，并進行了槐米發(fā)酵物對高尿酸血癥小鼠的影響實驗，研究表明槐米發(fā)酵物能顯著降低小鼠實驗性高尿酸血癥，對進一步開發(fā)槐米保健食品提供了一定的理論依據(jù)及技術支持.“葒草素和異葒草素抗氧化活性及對肝癌細胞增殖的影響”一文，對于廣泛存在于苦菜、蕎麥、山楂和竹筍等食品中的黃酮類物質(zhì)葒草素和異葒草素的抗氧化及抑制癌細胞增殖活性進行了較系統(tǒng)研究，對于富含該類成分的食品及其活性成分的開發(fā)利用具有重要意義.“鰱魚魚鱗膠原蛋白肽抗氧化作用研究”一文，利用富含膠原蛋白的魚類加工副產(chǎn)物魚鱗、魚皮、魚骨制備抗氧化活性肽，并進行了抗氧化活性評價，對于水產(chǎn)品副產(chǎn)物高附加值開發(fā)利用具有實際指導意義.(欄目主持人:李建科教授)

TS201

A

2095-6002(2013)06-0015-06

孫 紅，王昌祿，李貞景，等.黑曲霉M8固態(tài)發(fā)酵槐米對高尿酸血癥小鼠的影響.食品科學技術學報，2013，31(6):15－20.

SUN Hong，WANG Chang-lu，LI Zhen-jing，et al.Effects of Flos Sophorae’s Solid-state Fermention by Aspergillus niger M8 on Hyperuricemia Mice.Journal of Food Science and Technology，2013，31(6):15 －20.

2013-01-22

孫 紅，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術;

(責任編輯:葉紅波)