張會凱， 張曉煒， 王 珊， 翟留玉， 郭曉光， 張國華， 蔣國卿

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床表現(xiàn)為進行性認知功能障礙、記憶力減退及行為異常等，老年斑、神經(jīng)纖維纏結和神經(jīng)元減少是AD的主要病理改變。p38 MAPK信號通路可由紫外線、滲透壓變化、細胞因子和生理應激等激活，在應激反應如炎癥、細胞凋亡中發(fā)揮重要作用［1］，因此抑制p38 MAPK信號通路的活性、抑制炎癥因子的過度表達、降低tau蛋白的過度磷酸化有可能成為治療AD的有效方法。本研究通過觀察丁苯酞對AD模型大鼠行為學改變及大鼠海馬組織p38 MAPK、tau蛋白的表達的影響，探討其對AD的治療作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 采用健康清潔級雄性SD大鼠，體重為250±50g，月齡4個月，由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供。按隨機數(shù)字表法隨機分為空白組、模型組、丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組，每組8只。所有大鼠均在通風、避光、自由進食的條件下飼養(yǎng)。

1.2 動物模型的制作 10%水合氯醛(0.4 ml/100g)腹腔注射麻醉后，固定于大鼠大腦立體定位儀上，參照包新民《大鼠腦立體定位圖譜》定位，采用微量注射器雙側海馬緩慢注射凝聚態(tài)Aβ1-42各5μl(1μg/μl)誘導 AD 模型。

1.3 主要藥物和試劑 丁苯酞由石藥集團恩必普藥業(yè)公司提供(批號118120213)，用食用麻油稀釋成8mg/ml的溶液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫鶕?jù)人和動物按體表面積折算的等效劑量［2］，高劑量組按80mg/kg灌胃、低劑量組按40mg/kg灌胃，空白組、模型組均給以等體積的食用麻油灌胃，每日2次，所有動物均在造模2w后開始藥物干預，藥物干預共4w。

Aβ1-42(美國Sigma公司)，β-actin單克隆抗體(美國Sigma公司)，tau單克隆抗體(美國Bioworld公司)及P-tau蛋白單克隆抗體(美國Bioworld公司)，p38 MAPK單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)及磷酸化P38MAPK單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)。

1.4 觀察指標

1.4.1 實驗動物行為學檢測 Morris水迷宮［3］是一個直徑為200cm、深60cm的圓形水箱，平均分成4個象限，水面下2cm處有一個直徑為9cm的平臺，平臺位于其中1個象限的中心。造模1w后及藥物干預4w后分別進行水迷宮實驗，前5d進行定位航行實驗，記錄大鼠從4個不同象限入水至爬上平臺的時間(s)，即逃避潛伏期，如果在120s內(nèi)未能發(fā)現(xiàn)平臺，將其引至平臺停留10s，這個象限記為120s，上午和下午各進行1次，每日2次4個象限的平均值記為大鼠當日的結果。第6天撤除平臺，記錄60s內(nèi)大鼠游過原平臺的次數(shù)，每日2次，取2次的平均值作為大鼠游過平臺的次數(shù)。

1.4.2 大鼠腦片HE染色 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露心臟，經(jīng)心尖處穿刺至升主動脈，同時剪開右心耳，0.01mol PBS灌注至流出液為澄清時改為4%多聚甲醛灌注約30min，迅速斷頭取腦，于4%多聚甲醛中固定24h，常規(guī)冠狀切片，厚度為10μm，經(jīng)蘇木色精染液，伊紅染液，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4.3 p38 MAPK的表達 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，斷頭低溫分離海馬組織，微波勻漿，低溫10000轉/分離心，取上清即為全蛋白提取物，BCA法測蛋白濃度，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳，轉印至 PVDF膜上，封閉后分別用 β-actin、tau、P-tau、p38 MAPK及P-p38 MAPK抗體4℃水平搖床過夜，二抗室溫下?lián)u床孵育1h，洗膜后利用Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)掃膜分析得出 β-actin、tau、P-tau、p38 MAPK及P-p38 MAPK的灰度值，計算出P-tau與tau、P-p38 MAPK與p38 MAPK灰度值的比值表示P-tau、P-p38 MAPK 水平;tau、p38 MAPK 與相應的β-actin灰度值的比值表示tau、p38 MAPK水平。

1.4.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。非正態(tài)或方差不齊者各組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，組間兩兩比較采用Games-Howell檢驗。檢驗水準:α＜0.05。

2 結果

2.1 行為學檢測結果 造模1w后，4組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)不同(P＜0.05)。與空白組比較，模型組和丁苯酞低、高劑量組逃避潛伏期時間明顯延長(P＜0.05)，穿越平臺次數(shù)明顯減少(P＜0.05)。藥物干預4w后，4組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)不同(P＜0.05)。與模型組比較，丁苯酞低、高劑量組逃避潛伏期時間縮短(P＜0.05)，穿越平臺次數(shù)增多(P＜0.05);與低劑量組比較，高劑量組逃避潛伏期時間縮短(P＜0.05)，穿越平臺次數(shù)增多(P＜0.05)(見表1)。

2.2 大鼠海馬組織tau蛋白、p38 MAPK蛋白的表達 tau、p38 MAPK在4組大鼠中表達水平無明顯變化(P ＞0.05)，P-tau、P-p38 MAPK 在 4組大鼠中表達水平不同(P＜0.05)。與空白組比較，模型組和丁苯酞低、高劑量組P-tau、P-p38 MAPK表達升高(P＜0.05)。與模型組比較，丁苯酞低、高劑量組P-tau、P-p38 MAPK 表達降低(P ＜0.05)。與低劑量組比較，高劑量組P-tau、P-p38 MAPK表達明顯降低(P ＜0.05)(見表2、圖1)。

2.3 大鼠海馬組織CA1區(qū)HE染色(100倍)空白組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞排列緊密規(guī)則，未見明顯的細胞壞死;模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞明顯疏松，層次模糊，大量神經(jīng)細胞死亡;丁苯酞低劑量組可見部分錐體細胞壞死，排列比較規(guī)則;丁苯酞高劑量組錐體細胞壞死較少，排列基本規(guī)則(見圖2)。

表1 藥物干預前、干預4w后Morris水迷宮試驗結果(±s)

表1 藥物干預前、干預4w后Morris水迷宮試驗結果(±s)

與空白組比較*P＜0.05;與模型組比較#P＜0.05;與低劑量組比較△P＜0.05

組別 例數(shù) 藥物干預前逃避潛伏期(s)穿越平臺次數(shù)藥物干預4w后逃避潛伏期(s)穿越平臺次數(shù)空白組模型組低劑量組高劑量組8 8 8 8 43.940 ±4.032 80.380 ±6.775*77.380 ±6.510*78.680 ±8.878*5.550 ±1.141 3.900 ±0.907*4.150 ±0.784*3.850 ±1.001*46.349 ±5.227 83.337 ±6.009 65.720 ±6.307#50.367 ±7.301#△5.783 ±1.302 3.747 ±0.874 4.551 ±0.820#5.347 ±0.960#△

表2 大鼠海馬tau、p38 MAPK灰度比值(±s)

表2 大鼠海馬tau、p38 MAPK灰度比值(±s)

與空白組比較*P ＞0.05，#P ＜0.05;與模型組比較△P ＜0.05;與低劑量組比較▽P ＜0.05

組別tau P-tau p38 MAPK P-p38 MAPK空白組模型組低劑量組高劑量組0.805 ±0.372 0.794 ±0.397*0.736 ±0.401*0.820 ±0.433*0.197 ±0.034 0.499 ±0.047#0.325 ±0.038#△0.231 ±0.036#△▽0.828 ±0.408 0.874 ±0.428*0.921 ±0.519*0.947 ±0.541*0.180 ±0.049 0.517 ±0.052#0.362 ±0.046#△0.252 ±0.051#△▽

圖1 丁苯酞對tau、p38 MAPK表達的影響

3 討論

p38 MAPK信號通路是MAPK通路的一個重要分支，通過參與炎癥反應、tau蛋白過磷酸化、促神經(jīng)元凋亡等與其他信號傳遞途徑共同介導細胞應激誘發(fā)的基因表達和酶活性改變，在AD發(fā)病、進展中發(fā)揮重要作用［4］。Cui L［5］等發(fā)現(xiàn)腦缺血大鼠海馬組織p38 MAPK明顯升高，并且有大量神經(jīng)細胞凋亡，通過抑制p38 MAPK通路，缺血大鼠區(qū)神經(jīng)元凋亡明顯減少。老年斑和神經(jīng)原纖維纏結是AD的兩大特征性損害，越來越多的研究證實，Aβ在體內(nèi)外誘導tau蛋白過度磷酸化，破壞微管結構及穩(wěn)定性，損傷軸突轉運，最終引起神經(jīng)元死亡［6］。

丁苯酞能夠改善微循環(huán)、維護線粒體的結構和功能、降低腦缺血皮層calcineurin和calpain的活性，從而阻止神經(jīng)細胞凋亡的啟動，減輕腦缺血對AD發(fā)展的推動作用，改善AD大鼠的認知功能［7］。在實驗中丁苯酞低、高劑量組P-p38 MAPK的表達比模型組明顯降低，并且呈現(xiàn)出劑量相關性，隨著丁苯酞劑量的加大，表達隨之降低，表明丁苯酞明顯抑制了p38 MAPK的活性。長期慢性缺血缺氧導致大量炎癥因子產(chǎn)生，p38 MAPK被磷酸化，移位入核作用到相應的目標，激活下游多種轉錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)基因轉錄，誘導Bax轉位，介導caspase-3活化，上調(diào)TNF-α的表達，促使細胞凋亡［8］。另外磷酸活化的p38 MAPK進一步使IL-1、TNF-α等炎癥因子活化，直接損傷神經(jīng)元，而炎性因子反過來又強烈激活 p38 MAPK通路，形成一個逐漸增強的炎癥正反饋途徑［9］?，F(xiàn)已證明:老年斑的核心成分就是 Aβ。AD患者腦部存在慢性低灌注，長期缺血缺氧、線粒體發(fā)生功能障礙、促進炎癥因子的釋放、引起內(nèi)質網(wǎng)損傷、誘導β淀粉樣蛋白的異常形成。隨著β淀粉樣蛋白沉積量的增加，iNOS表達增高，p38 MAPK被磷酸活化，引起NO的高表達［10］。另外，大量活化的NF-κB，上調(diào)COX-2的表達，導致突觸減少、神經(jīng)元缺損、誘導海馬神經(jīng)元的凋亡，最終導致記憶及認知功能障礙［11］。實驗中還發(fā)現(xiàn):模型組P-tau表達最高，低劑量組較模型組降低，高劑量組下降最明顯，隨著藥物劑量的增加表達逐漸下降。相關研究發(fā)現(xiàn)Aβ可通過GSK-3β途徑增加tau蛋白異常磷酸化，從而引起tau蛋白介導的神經(jīng)退行性變。此外tau蛋白的過磷酸化是由蛋白激酶完成的，而MAPK是調(diào)節(jié)tau蛋白過度磷酸化的關鍵性激酶之一。p38 MAPK是MAPK的重要家族組成部分［12］，因此p38 MAPK信號轉導途徑可能參與了早期SP的形成，Aβ在大腦中的過量生成和聚集，使p38 MAPK磷酸化，進一步促進tau的過磷酸化，繼而出現(xiàn)中樞整合功能異常。

通過抑制p38 MAPK的活性，一方面抑制其對促炎信號的轉導作用;另一方面抑制其作為炎性細胞因子的下游信號中繼而介導的炎癥引發(fā)的有害效應，減輕小膠質細胞引起的炎性反應，降低tau蛋白的異常磷酸化及IL-1、TNF-α等炎癥因子的表達，從而發(fā)揮其改善AD大鼠學習記憶能力的作用［13］。因此，丁苯酞可能會成為臨床治療AD的新藥物，可以通過抑制p38 MAPK的活性來減輕Aβ誘導的tau蛋白過度磷酸化，但是具體通過何種途徑抑制 p38 MAPK的活性從而減輕tau蛋白磷酸化。目前尚不清楚，具體機制還需要更深入的研究。

圖2 大鼠海馬組織CA1區(qū)HE染色(100倍)

［1］Ando K，Uemura K，Kuzuya A，etal.N-cadherin regulates p38 MAPK signaling via association with JNK-associated leucine zipper protein:implications for neurodegeneration in Alzheimer disease［J］.J Biol Chem，2011，286(9):7619-7628.

［2］趙 偉，孫國志.不同種實驗動物間用藥量換算［J］.實驗動物，2010，5:52-53.

［3］Morris R.Development of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat［J］.JNeurosci Methods，1984，11(1):47-60.

［4］Liu XP，Zheng HY，Qu M，etal.Upregulation of astrocytes protein phosphatase-2A stimulates astrocytes migration via inhibiting p38 MAPK in tg2576 mice［J］.Glia，2012，60(9):1279-1288.

［5］Cui L，Zhang X，Yang R，etal.Neuroprotection of early and short-time applying atorvastatin in the acute phase of cerebral ischemia:downregulated 12/15-LOX，p38 MAPK and cPLA2 expression，ameliorated BBB permeability［J］.Brain Res，2010，1325:164-173.

［6］Philip JDolan，Gail VW Johnson.The role of tau kinases in Alzheime’s disease［J］.Curr Opin Drug Discov Devel，2010，13(5):595-603.

［7］Maddahi A，Edvinsson L.Cerebral ischemia induces microvascular pro-inflammatory cytokine expression via the MEK/ERK pathway［J］.JNeuroinflammation，2010，7:14.

［8］Jong-Hoon Lim，Jae-Suk Woo，Yung-Woo Shin.cilostazol protects endothelial cells against lipopolysaccharide-induced apoptosis through ERK1/2-and p38 MAPK-dependent pathways［J］.Korean J Intern Med，2009，24(2):113-122.

［9］Alma Sanchez，Debjani Tripathy，Xiangling Yin，etal.p38 MAPK:A mediator of hypoxia-induced cerebrovascular inflammation ［J］.J Alzheimer＇s Dis，2012，32(3):587-597.

［10］Medeiros R，Prediger RS，Passos GF，etal.Connecting TNF-alpha signaling pathways to iNOS expression in a mouse model of Alzheimer＇s disease:relevance for the behavioral and synaptic deficits induce by amyloid beta protein［J］.JNeurosic，2007，27(20):5394-5404.

［11］張桂蓮，姚 麗，杜 赟.p38 MAPK在Aβ25-35誘導AD大鼠海馬CA1區(qū)表達的研究［J］.南方醫(yī)科大學學報，2008，28(7):1176-1179.

［12］宋錦秋，陳小春，張 靜，等.人參皂苷Rbl通過JNK/p38 MAPK途徑減輕Aβ25-35誘導的胎鼠皮層神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化［J］.藥學學報，2008，43(1):29-34.

［13］侯德仁，田 怡，周 軍.丁苯酞對阿爾茨海默病模型大鼠p38及ERK表達的影響及意義［J］.南方醫(yī)科大學學報，2009，29(8):1592-1595.