程道賓， 陳小武

14-3-3蛋白與α-synuclein在結構上具有同源性，二者能相互作用并共存于Lewy體，提示14-3-3蛋白參與了帕金森病的發(fā)?。?，2］。研究發(fā)現14-3-3基因轉移對多巴胺能神經元具有保護作用［3～5］。LRRK2(leucine-rich repeat kinase 2)與家族性及散發(fā)性帕金森病均有關［6］，然而LRRK2突變致帕金森病的機制仍不十分清楚。研究發(fā)現14-3-3蛋白亦與LRRK2相互作用［7］，它們的相互作用在帕金森病的發(fā)病中有何作用及意義尚不完全清楚。因此本實驗擬通過過表達14-3-3γ蛋白，探討14-3-3蛋白與LRRK2相互作用在帕金森病發(fā)病中的作用及機制。

1 材料和方法

1.1 Ad/14-3-3γ的構建、鑒定、擴增與滴度測定 Ad/14-3-3γ的構建與鑒定詳見文獻［8］。病毒儲存液在HEK293細胞(Clontech公司)中進行反復擴增，按Graham的方法［9］對重組腺病毒Ad/14-3-3γ上清采用氯化銫(CsCl)密度梯度離心法和透析法純化，采用改進的TCID50法檢測病毒滴度。病毒滴度用蝕斑形成單位(plaque forming unit，pfu)/L表示，測得重組的Ad/14-3-3γ滴度為3.0×1012pfu/L。

1.2 PC12細胞的培養(yǎng)及實驗分組 野生型大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC12)CCTCC。細胞接種于含5% 胎牛血清(Gibco)、10% 馬血清(Gibco)的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2及飽和濕度，2～3d換液，生長至70% ～80%豐度時，吹打細胞傳代。

按處理不同實驗分為3組:(1)正常對照組:PC12細胞不加任何藥物處理;(2)魚藤酮組:PC12細胞加入新鮮配置的魚藤酮(終濃度為20nmol/L，Sigma公司)培養(yǎng)48h;(3)Ad/14-3-3γ組:用重組腺病毒Ad/14-3-3γ按感染復數MOI:25感染PC12細胞，48h后加入新鮮配置的魚藤酮(終濃度為20nmol/L)培養(yǎng)48h。

1.3 RT-PCR 檢測14-3-3 γ mRNA 表達 分別提取Ad-null和Ad/14-3-3 γ感染的PC12細胞及未加任何處理的PC12細胞總RNA，逆轉錄和PCR，以β-actin作為內參照。14-3-3γ引物由上海生工合成。上游引物序列為:5’GGAGGGTCATCAGTAGCATT3’，下游引物序列為:5’GCCAGGTAGCGGTAGTAGTC3’;合成的片段長度226bp。β-actin引物上游序列為:5’GTGGGCCGCTCAAGGCACCAA3’，下游序列為:5’CTTTAGCACGCACTGTAGTTTCTC3’，引物片段長度 540bp。β-actin PCR 擴增產物 1μl、14-3-3γ PCR擴增產物2μl，經過3%瓊脂糖凝膠電泳，條帶灰度值用圖像分析系統(tǒng)測定。

1.4 流式細胞儀檢測PC12細胞凋亡率 采用annexin V-FITC/PI雙標法，試劑盒購自上海鼎杰生物技術有限公司。調整細胞濃度至(0.5～1.0)×106/ml，每組各取1ml細胞，實驗按試劑盒說明操作。

1.5 激光共聚焦顯微鏡觀察14-3-3蛋白與LRRK2的免疫熒光雙標染色 將細胞接種于24孔板中，細胞生長到70% ～80%豐度時，按分組分別處理。先用4%多聚甲醛固定細胞30min，PBS洗5min×3次，再用牛血清白蛋白孵育30min;同時滴加兔抗14-3-3蛋白抗體(1∶200，Santa Cruz公司)和小鼠抗LRRK2抗體(1∶200，sigma公司)，4℃孵育過夜;PBS洗5min×3次，同時滴加FITC標記的羊抗兔二抗(1∶200，南京 Oddfoni公司)及 Texas Red標記的驢抗鼠二抗(1∶200，南京 Oddfoni公司)37℃孵育1h;PBS漂洗后甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察、照相。

1.6 免疫印跡法檢測蛋白的表達 提取蛋白，BCA法測定蛋白質濃度。取總蛋白20μg，15%SDSPAGE電泳，電轉法轉移到NC膜上，NC膜在室溫下用5%脫脂牛奶-PBS封閉1h;兔抗14-3-3 γ抗體(1∶500，Santa Cruz公司)，兔抗LRRK2 p-Ser910 抗體及LRRK2 p-Ser935抗體(1∶500，Epitomics公司)或小鼠抗LRRK2抗體(1∶500，Epitomics公司)和小鼠抗γ-tubulin抗體(1∶10000，Sigma)4℃孵育24h;HRP標記的羊抗兔(1∶5000，Pierce公司)或大鼠抗小鼠IgG(1∶4000，Sigma公司)室溫孵育2h;化學發(fā)光法顯影，掃描。用圖像處理系統(tǒng)對條帶灰度進行分析，免疫印跡條帶按面積×灰度計算，每個樣本的免疫印跡條帶均與同一樣本的總LRRK2比較后作統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測14-3-3γ mRNA的表達 各組間β-actin mRNA的表達無差異。Ad/14-3-3γ組14-3-3γ mRNA表達顯著高于正常對照組和Ad-null組(見圖1)。

2.2 Western blot檢測14-3-3γ蛋白的表達及LRRK2-Ser910及LRRK2-Ser935的磷酸化水平 與正常對照組相比，魚藤酮組14-3-3γ蛋白表達水平及LRRK2-Ser910與LRRK2-Ser935的磷酸化水平顯著下降，與魚藤酮組相比較，Ad/14-3-3γ組14-3-3γ蛋白的表達水平及LRRK2-Ser910與LRRK2-Ser935的磷酸化水平顯著增高(見圖2)。

2.3 免疫雙標激光共聚焦顯微鏡對14-3-3γ蛋白與LRRK2相互作用的檢測 魚藤酮組14-3-3γ蛋白與LRRK2的結合與正常對照組及Ad/14-3-3γ組相比顯著減少(見圖3)。

2.4 流式細胞儀對PC12細胞凋亡率的檢測左下象限為正常細胞，左上象限為PI單標記的壞死細胞;右下象限為Annexin V-FITC單標記的早期凋亡細胞，右上象限為Annexin V-FITC/PI雙標的晚期凋亡細胞，早期和晚期的凋亡細胞合計為凋亡細胞。正常對照組細胞凋亡率為4.26% ±1.39%，魚藤酮組與正常對照組相比細胞凋亡率顯著增高(36.20% ±2.18%，P ＜0.01)，Ad/14-3-3γ 組細胞的凋亡率(12.78% ±2.96%)與魚藤酮組比較顯著降低(P＜0.05)(見表1)(見圖4)。

表1 流式細胞儀檢測PC12細胞的凋亡率(%，，n=3)

表1 流式細胞儀檢測PC12細胞的凋亡率(%，，n=3)

與正常對照組相比#P＜0.01;與魚藤酮組比較*P＜0.05，每組計數的細胞數1×104

93.67 ±3.58 59.42 ±3.26 87.75 ±5.43分組 凋亡細胞 壞死細胞 活細胞正常對照組魚藤酮組Ad/14-3-3 γ組4.26 ±1.39 36.20 ±2.18#12.78 ±2.96*1.55 ±0.72 1.49 ±0.91 1.37 ±0.73

圖1 腺病毒感染PC12細胞48h后RT-PCR檢測結果

圖2 Western blot檢測14-3-3γ蛋白的表達及LRRK2-Ser910及LRRK2-Ser935的磷酸化水平

3 討論

14-3-3蛋白因與α-synuclein具有同源性并共存于Lewy體中而提示其參與了帕金森病的發(fā)病［1，2］。我們的研究也顯示帕金森病大鼠模型及細胞模型中14-3-3蛋白表達水平明顯減少［10，11］，并且過表達14-3-3蛋白對多巴胺能神經元具有保護作用［3～5］。本實驗的結果亦顯示，通過腺病毒載體將14-3-3γ基因轉入PC12細胞能抵抗魚藤酮的毒性，降低PC12細胞的凋亡率(見圖4和表1)，對多巴胺能細胞具有保護作用。

圖3 免疫熒光雙標激光共聚焦顯微鏡檢測14-3-3γ蛋白與LRRK2的相互作用

圖4 流式細胞儀檢測PC12細胞的凋亡率

最近的資料表明，LRRK2基因的突變與遺傳性帕金森病及散發(fā)性帕金森病均有關［6］，提示遺傳性及散發(fā)性PD可能有共同的發(fā)病機制，LRRK2可能是聯系二者的橋梁。目前LRRK2基因的突變導致帕金森病的發(fā)病機制尚未完全清楚。研究發(fā)現14-3-3蛋白能與LRRK2相互作用［7］，我們通過免疫雙標的方法也證實了上述發(fā)現(見圖3)。LRRK2的Ser910及Ser935是與14-3-3蛋白結合的兩個主要位點［12］，我們的實驗發(fā)現，在魚藤酮制作的PD細胞模型中，LRRK2的Ser910及Ser935的磷酸化水平顯著下降，而14-3-3 γ蛋白的過表達能顯著增加這兩個位點的磷酸化水平(見圖2)。有趣的是，LRRK2的幾個常見的突變位點都表現出 LRRK2的 Ser910及Ser935的磷酸化水平下降［13］。因此我們推測，14-3-3蛋白的過表達使其與LRRK2的Ser910及Ser935位點牢固結合，阻止LRRK2的p-Ser910及p-Ser935的去磷酸化，維持LRRK2酶的活性及正常生理功能。

總之，本實驗提示14-3-3γ蛋白的過表達可能通過增加LRRK2的Ser910及Ser935的磷酸化水平，對魚藤酮誘導的PC12細胞的損傷發(fā)揮防護作用。

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