鄭文思 趙廣永 張婷婷 牛文靜 董瑞蘭

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

反芻動(dòng)物的瘤胃中生活著大量微生物，能夠發(fā)酵飼料中的碳水化合物，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、甲烷(CH4)、二氧化碳(CO2)和氫氣(H2)。瘤胃內(nèi)的CH4主要是由產(chǎn)甲烷菌利用CO2和H2合成的［1］。瘤胃內(nèi)CH4的產(chǎn)生一方面造成飼料能量損失;另一方面還會(huì)加重地球溫室效應(yīng)。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織2006年的統(tǒng)計(jì)，家畜產(chǎn)生的溫室氣體占地球溫室氣體排放量的18%，而其中73%來(lái)自反芻動(dòng)物。反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的CH4占反芻動(dòng)物CH4總產(chǎn)量的90%［2］。準(zhǔn)確預(yù)測(cè)反芻動(dòng)物的CH4產(chǎn)量是降低瘤胃CH4排放的基礎(chǔ)。

飼糧營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)瘤胃CH4產(chǎn)量具有重要影響。據(jù)報(bào)道，飼糧干物質(zhì)采食量(dry matter intake，DMI)［3-5］、能量消化率［6］、非纖維碳水化合物(non-fibre carbohydrate，NFC)、半纖維素和纖維素(cellulose，C)［7］、可消化粗蛋白質(zhì)(digestible crude protein，DCP)、可消化粗脂肪(digestible ether extract，DEE)、可消化粗纖維(digestible crude fiber，DCF)和可消化無(wú)氮浸出物［5］以及代謝能采食量(metabolizable energy intake，MEI)和飼草比例［3］均與反芻動(dòng)物CH4產(chǎn)量之間均存在顯著的相關(guān)關(guān)系。但是，在生產(chǎn)實(shí)際中，應(yīng)用飼糧的營(yíng)養(yǎng)成分或反芻動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)采食量預(yù)測(cè)瘤胃CH4產(chǎn)量并不十分方便。

飼糧精粗比是反映反芻動(dòng)物飼糧特性的重要指標(biāo)。一些研究表明，飼糧精粗比對(duì)瘤胃CH4產(chǎn)量有顯著影響。韓繼福等［8］研究結(jié)果表明，隨著飼糧精料比例(concentrate ratio，CR)的提高，肉牛單位代謝體重的CH4產(chǎn)量下降。Chandramoni等［9］研究結(jié)果表明，隨著飼糧精料比例提高，綿羊的CH4產(chǎn)量下降。精料比例越高，通過(guò)CH4損失的飼料能量比例越低［10］。反芻動(dòng)物飼糧的精料比例一般不高于50%，但在肉?？焖儆孰A段，為了加快肉牛的脂肪沉積，提高牛肉嫩度，在高強(qiáng)度育肥條件下，肉牛飼糧的精料比例可達(dá)80%～100%［11］。

飼料中的結(jié)構(gòu)性碳水化合物(structural carbohydrates，SC)主要包括中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(nonstructural carbohydrates，NSC)主要包括淀粉、可溶性糖和果膠。因此飼糧NSC/NDF可被認(rèn)為是更為準(zhǔn)確的日糧精粗比。本試驗(yàn)擬研究高精料條件下，肉牛飼糧NSC/NDF與體外發(fā)酵CH4產(chǎn)量之間的關(guān)系，闡明根據(jù)飼糧NSC/NDF與CH4產(chǎn)量之間關(guān)系預(yù)測(cè)瘤胃內(nèi)CH4產(chǎn)量的可能性和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

以2頭年齡為2.5歲、體重約為600 kg，裝有永久性瘤胃瘺管的西門(mén)塔爾去勢(shì)公牛作為瘤胃液供體，拴系飼養(yǎng)。瘤胃液供體牛的日糧組成為:精料 2.0 kg，羊草(Chinese wildrye，CW)6.0 kg。其中精料組成為:玉米58%、豆粕20%、麥麩(wheat bran，WB)18%、磷酸氫鈣2%、食鹽1%、預(yù)混料1%。每天07:00和17:00分2次飼喂，自由飲水。

1.2 試驗(yàn)飼糧和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

應(yīng)用13種肉牛常用飼料為原料，包括精料玉米、豆粕、麥麩、棉籽粕(cottonseed meal，CM)、菜籽粕(rapeseed meal，RM)、次粉(wheat middling，WM)和粗料干酒糟及其可溶物(DDGS)、稻草(rice straw，RS)、麥秸(wheat straw，WS)、玉米秸(corn stover，CS)、谷草(millet straw，MS)、羊草和苜蓿。將風(fēng)干飼料樣品粉碎過(guò)1 mm網(wǎng)篩，用于配制試驗(yàn)飼糧。共設(shè)計(jì) 5個(gè)精粗比(60∶40、70∶30、80∶20和 90∶10 和100∶0)，每個(gè)精粗比設(shè)計(jì) 10 種飼糧，共50種試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)飼糧組成見(jiàn)表1，營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

1.3 體外發(fā)酵

應(yīng)用Menke等［12］的體外產(chǎn)氣法進(jìn)行體外發(fā)酵。應(yīng)用容積為150 mL、可計(jì)量容積為100 mL的玻璃注射器作為發(fā)酵容器，應(yīng)用能夠精確控制溫度的生化培養(yǎng)箱控制培養(yǎng)溫度。

根據(jù)Menke等［12］的方法配制緩沖液。緩沖試劑 A 液:將 CaCl2·H2O 13.2 g、MnCl2·4H2O 10.0 g、CoCl2·6H2O 1.0 g 和 FeCl3·6H2O 8.0 g溶解于蒸餾水中，定容至100 mL;緩沖試劑B液:將NaHCO335.0 g和NH4HCO34.0 g溶解于蒸餾水中，定容至 1 000 mL;緩沖試劑 C液:將Na2HPO45.7 g、KH2PO46.2 g 和 MgSO4·7H2O 0.6 g溶解于蒸餾水中，定容至1 000 mL;還原劑溶液:將 1 N NaOH 20 mL和 Na2S·9H2O 3.125 g溶解于475 mL蒸餾水中。將上述溶液按照下列順序混合:400 mL蒸餾水、0.1 mL A液、200 mL B液、200 mL C液、40 mL還原劑溶液，混合均勻。

試驗(yàn)牛經(jīng)預(yù)飼12 d后，從第13天開(kāi)始采集瘤胃液。在早晨飼喂后2 h，通過(guò)瘤胃瘺管分別從每頭牛瘤胃中采集瘤胃液250 mL左右，使用4層紗布過(guò)濾瘤胃液，并且混合均勻，置于保溫瓶?jī)?nèi)。用pH計(jì)快速測(cè)定瘤胃液pH，然后將瘤胃液與緩沖液以1∶2的體積比例混合均勻，并且持續(xù)通入CO2氣體。

分別稱取0.200 0 g風(fēng)干飼料樣品，放入注射器內(nèi)頂端。每個(gè)飼糧設(shè)置4個(gè)重復(fù)。每個(gè)注射器內(nèi)吸取30 mL培養(yǎng)液。將注射器中的氣體排凈，并密封注射器頂端。將注射器放入39℃的生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵。每批發(fā)酵飼料樣品設(shè)置3個(gè)不含飼料樣品的注射器作為空白對(duì)照。

發(fā)酵持續(xù)進(jìn)行48 h。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，讀取并記錄注射器活塞刻度，以計(jì)算發(fā)酵總產(chǎn)氣量。迅速測(cè)定培養(yǎng)液pH，分別采集5 mL氣體樣品和5 mL發(fā)酵液樣品。向5 mL發(fā)酵液樣品中加入1 mL濃度為25%偏磷酸溶液，在4℃下高速離心(15 000×g)15 min，取上清液置于-20℃的冰箱中保存。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

分別使用 AOAC(1990)［13］的標(biāo)準(zhǔn)方法934.01、920.39和924.05測(cè)定飼料的干物質(zhì)(dry matter，DM)、粗脂肪(ether extract，EE)和粗灰分(ash)含量。應(yīng)用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)含量。應(yīng)用Van Soest等［14］的方法測(cè)定NDF含量。在測(cè)定NDF含量后，直接測(cè)定飼料的中性洗滌劑殘留物的CP，作為中性洗滌劑不溶粗蛋白質(zhì)(neutral detergent insoluble CP，NDICP)。

使用氣相色譜儀(TP-2060T，北京北分天普儀器有限公司)測(cè)定發(fā)酵氣體中的CH4和CO2產(chǎn)量。測(cè)定條件為:熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)，TDX-01色譜柱，規(guī)格1 m×2 mm×3 mm，柱溫70℃，檢測(cè)器溫度100℃。載氣為氬氣(He)。標(biāo)準(zhǔn)氣體組成(體積比)為:CH426.796%、CO265.300%、氧氣(O2)0.605%、氮?dú)?N2)7.100%、H20.199%。

表1 試驗(yàn)飼糧組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition of experimental diets(DM basis) %

續(xù)表1

表2 試驗(yàn)飼糧的營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Nutrient levels of experimental diets(DM basis)

續(xù)表2

使用氣相色譜儀(TP-2060F，北京北分天普儀器有限公司)測(cè)定發(fā)酵液中的VFA產(chǎn)量。測(cè)定條件為:火焰離子檢測(cè)器(FID)，PEG-20M+H3PO4玻璃柱，柱溫120℃，檢測(cè)器溫度220℃。載氣為 He、H2和空氣，流速分別為 30、30和300 mL/min。每個(gè)樣品取2μL用于分析。標(biāo)準(zhǔn)揮發(fā)性脂肪酸的組成為:乙酸42.0 mmol/L、丙酸32.1 mmol/L、異丁酸 2.0 mmol/L、丁酸14.0 mmol/L、 異戊酸 7.0 mmol/L、戊酸3.0 mmol/L、2-乙基丁酸4.0 mmol/L。其中2-乙基丁酸用作內(nèi)標(biāo)物。

1.5 計(jì)算方法

總 產(chǎn) 氣 量、CH4、CO2、總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸和丁酸產(chǎn)量計(jì)算方法如下:

式中;Y樣品為樣品的氣體(mL/g)或VFA產(chǎn)量(μmol/g);Y發(fā)酵液為發(fā)酵液的氣體(mL/g)或VFA產(chǎn)量(μmol/g);Y空白為空白的氣體(mL/g)或VFA產(chǎn)量(μmol/g);DM為飼料樣品干物質(zhì)含量(g)。

飼料樣品的碳水化合物(CHO)和NSC含量(%，干物質(zhì)基礎(chǔ))計(jì)算方法如下:

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPSS 16.0分析飼糧精料比與各指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系。分析模型為:y=b x+a(式中，y為體外發(fā)酵指標(biāo)，x為飼糧NSC/NDF)。P＜0.05為相關(guān)關(guān)系顯著，P＜0.01為極顯著。

2 結(jié)果

體外發(fā)酵飼糧樣品的氣體及VFA產(chǎn)量見(jiàn)表3。

2.1 飼糧NSC/NDF與產(chǎn)氣量之間的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，飼糧NSC/NDF(x，%)與體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量(y1，mL/g)、CH4(y2，mL/g)和CO2產(chǎn)量(y3，mL/g)之間均存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。

2.2 飼糧NSC/NDF與不同發(fā)酵指標(biāo)比例之間的關(guān)系

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，飼糧NSC/NDF比例(x，%)與體外發(fā)酵乙酸/丙酸(y4，%)和 CH4/TVFA(y5，mL/mmol)之間存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P ＜0.01)，但與 CO2/TVFA(y6，mL/mmol)之間的相關(guān)關(guān)系不顯著(P＞0.05)。

3 討論

飼料的SC主要包括NDF，NSC主要包括淀粉、可溶性糖和果膠。因此，考慮到碳水化合物組成，飼糧NSC/NDF可被看作更為精確的飼糧精粗比。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧NSC/NDF與體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量、CH4、CO2產(chǎn)量以及VFA產(chǎn)量之間均存在顯著正相關(guān)關(guān)系。這說(shuō)明飼糧的可發(fā)酵程度隨著飼糧NSC比例的提高而提高。這與飼糧精料比例與各發(fā)酵指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系一致。

本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，飼糧NSC/NDF與體外發(fā)酵與乙酸/丙酸和CH4/TVFA之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。說(shuō)明隨著飼糧NSC比例的提高，乙酸的比例下降，丙酸的比例提高，即NSC有利于提高丙酸的產(chǎn)量。另外，隨著飼糧NSC比例的提高，CH4的相對(duì)產(chǎn)量下降，這與飼糧精料比例與乙酸/丙酸和CH4/TVFA之間的關(guān)系一致。

需要指出的是，盡管飼糧NSC/NDF與總產(chǎn)氣量、CO2、CH4產(chǎn)量之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，但所有相關(guān)方程的相關(guān)系數(shù)也偏低。造成這一結(jié)果的原因是:1)盡管CH4、CO2是碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的，但CP、EE和粗灰分等均有可能影響碳水化合物發(fā)酵，進(jìn)而影響發(fā)酵產(chǎn)物CH4、CO2的產(chǎn)量;2)從理論上講，飼糧NSC和NDF含量與體外發(fā)酵指標(biāo)之間存在密切的相關(guān)關(guān)系，但飼糧NSC和NDF含量并不能代表被實(shí)際發(fā)酵的數(shù)量。

Moe等［7］研究表明，奶牛 CH4產(chǎn)量與可溶解殘留物(中性洗滌劑可溶解物-CP-EE)、半纖維素和纖維素采食量之間的決定系數(shù)R2=0.67，而奶牛CH4產(chǎn)量與消化的可溶解殘留物、半纖維素和纖維素之間的決定系數(shù)R2=0.73。Kirchgessner等［15］研究表明，反芻動(dòng)物的飼糧粗纖維、無(wú)氮浸出物、CP和EE采食量與反芻動(dòng)物CH4產(chǎn)量之間的多元決定系數(shù)R2=0.69。Jentsch等［5］研究表明，反芻動(dòng)物DCP、DEE、DCF和可消化無(wú)氮浸出物采食量與反芻動(dòng)物CH4產(chǎn)量之間的多元決定系數(shù)R2=0.896。比較上述結(jié)果可知，可消化營(yíng)養(yǎng)成分與反芻動(dòng)物CH4產(chǎn)量之間的相關(guān)關(guān)系更為密切，因?yàn)榭上癄I(yíng)養(yǎng)成分反映了動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分實(shí)際消化利用的過(guò)程。

NSC/NDF能夠很好地反映飼糧碳水化合物的組成成分，但與瘤胃發(fā)酵總產(chǎn)氣量、CH4、CO2產(chǎn)量以及乙酸/丙酸、CH4/TVFA、CO2/TVFA之間的相關(guān)程度并不高。這可能是因?yàn)镹SC/NDF并不能反映NSC和NDF在瘤胃中的可發(fā)酵程度?？梢酝茰y(cè)，可發(fā)酵NSC/可發(fā)酵NDF比例與瘤胃發(fā)酵總產(chǎn)氣量、CH4、CO2產(chǎn)量以及乙酸/丙酸、CH4/TVFA、CO2/TVFA之間的相關(guān)程度可能更高。因此，這一比例可能更適合作為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)飼糧瘤胃發(fā)酵情況的指標(biāo)。

?

4 結(jié)論

高精料飼糧條件下，隨著飼糧NSC/NDF的提高，飼糧體外發(fā)酵的CH4相對(duì)產(chǎn)量下降，但由于相關(guān)系數(shù)偏低，飼糧NSC/NDF不能作為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)飼糧體外發(fā)酵CH4產(chǎn)量的唯一指標(biāo)。

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