敬 婷 羅 莉 白富瑾 錢 前 孫玉軒 石亞慶 李 贊

(西南大學動物科技學院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，水產(chǎn)科學重慶市市級重點實驗室，重慶 400715)

L-蘋果酸是生物體代謝過程中產(chǎn)生的重要有機酸，是三羧酸循環(huán)(TCA)的中間代謝產(chǎn)物，可直接參與線粒體能量代謝［1］。同時，它又是蘋果酸-天冬氨酸穿梭的組成部分，對胞液和線粒體之間還原當量的轉移起著重要的作用［2］。L-蘋果酸在飼料添加劑方面的研究主要集中在反芻動物上，它可作為酸味劑提高飼料的適口性，降低飼料的pH，促進小腸的消化吸收，也可作為能量物質(zhì)直接被機體使用［3］。楊威等［4］報道反芻動物飼喂蘋果酸可以提高飼料的轉化率，提高動物的生長性能。而L-蘋果酸在水產(chǎn)動物中的研究僅見Hossain 等［5］對真鯛(sea bream)的研究，研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加1%蘋果酸對生長性能無顯著影響，但是可以增加磷的利用率，以及Michael等［6］對吉富羅非魚的研究，研究認為飼料中添加0.01 mol/L蘋果酸并不能刺激進食行為。而相近的研究則表明酸化劑能夠促進羅非魚［7］、草魚［8］、鯉魚［9］、湘云鯽［10］和虹鱒［11］等魚類的生長。本試驗以湘云鯽為研究對象，擬探討L-蘋果酸對其生長性能、體組成、消化和抗氧化能力的影響，并確定L-蘋果酸在其飼料中的適宜添加量，以期為湘云鯽飼料生產(chǎn)中合理應用蘋果酸提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

根據(jù)湘云鯽的營養(yǎng)需求，以秘魯魚粉、大豆粕(去皮膨化)、棉籽粕、菜籽粕等為主要原料配制基礎飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。在基礎飼料中分別添加 0(對照)、1、2、4、8 和 16 g/kg 的 L-蘋果酸(購自Sigma公司)，配制成6種試驗飼料。各試驗飼料制成粒徑為2.0 mm的顆粒飼料，60℃烘干后，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 試驗魚與飼養(yǎng)管理

試驗用魚為湘云鯽，購自重慶大足漁場。試驗魚先經(jīng)濃度3%的食鹽溶液消毒后，暫養(yǎng)于水族缸中，以基礎飼料馴化10 d。正式試驗開始前，選擇健康、均重為(16.25±0.03)g湘云鯽450尾，隨機分為6組，每組3個重復，每個重復25尾魚。養(yǎng)殖容器為180 L玻璃水族缸，水源為曝氣后的自來水，每天按體重的2% ～3%分4次投喂(08:00、11:00、14:00、17:00)，手動小心投飼直至魚不再攝食為止。每天18:00換水1次，換水量為100%，以保證水質(zhì)清新。試驗期90 d，試驗期間水溫22～30℃，pH 6.6～7.0，溶氧濃度大于5 mg/L，氨氮濃度小于0.05 mg/L。

1.3 樣品采集與指標測定

1.3.1 飼料pH和系酸力的測定

飼料pH采用Radecki等［12］推薦的方法:稱取20 g飼料放入燒杯中，分別加入40、60、80 mL去離子水，用玻璃棒稍用力攪拌至呈漿狀液后，用pHS-25(數(shù)顯)pH計測定不同稀釋率下的pH。飼料系酸力采用Bolduna等［13］推薦的方法測定:稱取100 g風干飼料(全部通過60目標準篩)放入燒杯中，加入200 mL去離子水，在恒溫水浴鍋中加熱至37℃左右，取下放在磁力攪拌器上攪拌并插入溫度計，將溫度控制在(37±1)℃。將pH計電極插入溶液中，用1 mol/L的鹽酸逐步進行滴定至pH=4.0時所用鹽酸的毫升數(shù)即為該飼料的系酸力。

1.3.2 生長性能指標的測定

試驗結束時試驗魚饑餓24 h后準確稱魚體和飼料重，測定其攝食量(feed intake，F(xiàn)I)、增重率(weight gain rate，WGR)和飼料系數(shù)(feed conversion ratio，F(xiàn)CR)，計算公式如下:

1.3.3 全魚體組成和飼料營養(yǎng)成分沉積率的測定

試驗前取5尾魚作為初始樣本，試驗結束后每重復隨機取5尾作為終末樣本，根據(jù)《飼料標準資料匯編》中的方法測定魚體以及飼料中水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分的含量，再計算飼料的蛋白質(zhì)沉積率(protein retention ratio，PRR)、脂肪沉積率(lipid retention ratio，LRR)和灰分沉積率(ash retention ratio，ARR)，計算公式如下:

1.3.4 消化和抗氧化指標的測定

養(yǎng)殖試驗結束稱重后，每組隨機取15尾魚，在冰盤中解剖，取出腸道和肝臟(剝除多余的脂肪和結締組織)，用生理鹽水(4℃)沖凈消化道內(nèi)容物，并用濾紙吸干水分后稱重，稱重后剪碎混勻，按1∶9(質(zhì)量體積比，g/mL)加入生理鹽水(4℃)，迅速轉入玻璃勻漿器勻漿(勻漿過程在冰浴環(huán)境中進行)，然后將勻漿液離心(4℃，3 500 r/min)10 min，取上清液制得粗酶液。將粗酶液置于-80℃超低溫冰箱中冷藏保存，用于腸道和肝臟各指標的測定。

腸道消化酶(淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶)和Na+/K+-ATP酶活性以及肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、蘋果酸脫氫酶(MDH)活性與丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。淀粉酶活性單位定義為:在37℃條件下，每毫克組織蛋白質(zhì)與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個酶活性單位。脂肪酶活性單位定義為:在37℃條件下，每克組織蛋白質(zhì)在本反應體系中與底物反應1 min，每消耗1μmol底物為1個酶活性單位。胰蛋白酶活性單位定義為:在pH 8.0、37℃條件下，每毫克組織蛋白質(zhì)中含有的胰蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003即為1個酶活性單位。Na+/K+-ATP酶活性單位定義為:每小時每毫克組織蛋白質(zhì)中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機磷的量為1個酶活性單位。組織中蛋白質(zhì)含量以牛血清蛋白為標準，用考馬斯亮藍法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與計算公式

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析(one-way ANOVA)，同時采樣Duncan氏法進行多重比較，P＜0.05為差異顯著。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 L-蘋果酸對飼料p H和系酸力的影響

由表2可知，飼料中添加L-蘋果酸對飼料pH和系酸力有顯著影響(P＜0.05)。隨著L-蘋果酸添加水平的提高，飼料pH和系酸力顯著下降(P＜0.05)，即飼料的酸度逐漸增高，在16.0 g/kg組達到最高。

表2 L-蘋果酸對飼料pH和系酸力的影響Table 2 Effects of L-malic acid on pH and acid-binding capacity of diets

2.2 L-蘋果酸對湘云鯽生長性能的影響

由表3可知，飼料中添加L-蘋果酸后湘云鯽的終末尾均重、增重率、攝食量均有所增加，而飼料系數(shù)則有所下降。其中，以4.0 g/kg組的生長效果最佳，與對照組相比，其增重率、攝食量分別提高了27.17%、26.77%(P＜0.05)，飼料系數(shù)則降低了16.40%(P＜0.05)。

表3 L-蘋果酸對湘云鯽生長性能的影響Table 3 Effects of L-malic acid on growth performance of triploid crucian carp(Carassius auratus)

2.3 L-蘋果酸對湘云鯽體組成及飼料營養(yǎng)成分沉積率的影響

2.3.1 L-蘋果酸對湘云鯽體組成的影響

由表4可知，飼料中L-蘋果酸添加水平為0～8 g/kg時，全魚水分含量逐漸下降，粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量逐漸增加。與對照組相比，8 g/kg組全魚水分含量降低了2.73%(P＜0.05)，而粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量分別增加了 4.60%、13.20%和13.03%(P＜0.05);4 g/kg組全魚水分含量降低了2.52%(P＜0.05)，而粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量分別增加了2.58%、10.53%和10.92%(P＜0.05);4、8 g/kg組之間上述指標差異不顯著(P＞0.05)。

表4 L-蘋果酸對湘云鯽體組成的影響(鮮重基礎)Table 4 Effects of L-malic acid on body composition of triploid crucian carp(Carassius auratus)(fresh weight basis) %

2.3.2 L-蘋果酸對湘云鯽飼料營養(yǎng)成分沉積率的影響

由表5可知，各L-蘋果酸添加組的蛋白質(zhì)、脂肪和灰分沉積率均較對照組顯著提高(P＜0.05)。其中，蛋白質(zhì)和脂肪沉積率均在4 g/kg組達到最大值，分別較對照組提高了32.13%和39.97%(P＜0.05);灰分沉積率在8 g/kg組達到最大值，較對照組提高了49.91%(P＜0.05)。

2.4 L-蘋果酸對湘云鯽腸道消化酶活性和Na+/K+-ATP酶活性的影響

由表6可見，隨著飼料中L-蘋果酸添加水平的增加，腸道淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和Na+/K+-ATP酶活性均呈先升高后降低的趨勢，且均在8 g/kg組達到最大值，分別較對照組提高了31.46%、96.98%、12.00% 和 42.30%(P＜0.05)。16 g/kg組(高添加水平組)的腸道淀粉酶和脂肪酶活性雖然比對照組顯著增加(P＜0.05)，但其胰蛋白酶和Na+/K+-ATP酶活性則均顯著低于對照組(P＜0.05)，分別比對照組降低了27.90%和49.30%。

表5 L-蘋果酸對湘云鯽飼料營養(yǎng)成分沉積率的影響Table 5 Effects of L-malic acid on dietary nutrient retention ratio of triploid crucian carp(Carassius auratus) %

表6 L-蘋果酸對湘云鯽腸道消化酶和Na+/K+-ATP酶活性的影響Table 6 Effects of L-malic acid on intestinal digestive enzyme and Na+/K+-ATPase activities of triploid crucian carp(Carassius auratus)

2.5 L-蘋果酸對湘云鯽肝臟SOD、MDH活性及MDA含量的影響

由表7可知，隨著飼料中L-蘋果酸添加水平的增加，肝臟SOD和MDH活性呈先升高后降低趨勢，而MDA含量則相反。在4.0 g/kg組，肝臟SOD和MDH活性達到最大值，MDA含量達到最小值，并均與對照組差異顯著(P＜0.05);在16.0 g/kg組，肝臟SOD和MDH活性較對照組降低了12.28%和46.15%(P＜0.05)，MDA含量增加了15.42%(P＜0.05)。

表7 L-蘋果酸對湘云鯽肝臟SOD、MDH活性及MDA含量的影響Table 7 Effects of L-malic acid on liver SOD and MDH activities and MDA content of triploid crucian carp(Carassius auratus)

3 討論

酸化劑對魚類生長的影響受多種因素影響，其中酸化劑的類型和添加量、魚的種類、飼料的營養(yǎng)水平與系酸力等是較為主要的因素。據(jù)報道，在飼料中添加2、3 g/kg的檸檬酸后鯉魚、羅非魚增重率分別提高了 12.3%［9］、12.5%［15］;檸檬酸還可促進草魚［8］、虹鱒［11］、中國對蝦［16］和異育銀鯽［17］的生長;乳酸和磷酸對羅非魚也有一定的促生長作用［18］;但在革胡子鯰飼料中添加檸檬酸并無明顯促生長作用［19］。本研究以湘云鯽為研究對象，添加1～16 g/kg的L-蘋果酸，結果顯示，飼料中添加L-蘋果酸后，湘云鯽的生長和對飼料的利用效果都得到提高，其中4 g/kg組生長效果最佳，這與潘慶等［20］在羅非魚飼料中添加1～4 g/kg的檸檬酸得到的結果相似。

蘋果酸的促生長機制與其可降低飼料和消化道pH，提高消化酶活性有關。對無胃魚而言，酸性食糜可刺激十二指腸和胰臟分泌更多的消化液以中和其中的酸，以此為腸道中消化酶提供適宜pH環(huán)境［21］。飼料系酸力可反映飼料結合酸的能力，系酸力越高的飼料，酸結合能力越強，在消化道內(nèi)結合的游離酸就越多，導致消化道內(nèi)pH升高越多，破壞魚類適宜消化吸收的酸性環(huán)境。大量研究結果表明，降低飼料系酸力能有效提高畜禽飼料采食量，促進生長發(fā)育，并大幅提高日增重和飼料轉化率［22-24］。本試驗結果表明，在湘云鯽飼料中添加適量L-蘋果酸后，飼料系酸力降低，湘云鯽攝食量和增重率增加，這與上述研究結果相一致。目前蘋果酸對魚類消化酶活性影響的研究尚未見報道，相近的研究表明，羅非魚飼料中添加1～4 g/kg的檸檬酸，飼料pH呈下降趨勢，胃蛋白酶、肝胰臟蛋白酶、腸道淀粉酶活性呈先上升后下降趨勢［20］;王紀亭等［21］報道，在鯉魚飼料中添加0.3%的復合酸，顯著提高了肝胰臟、腸道蛋白酶活性，淀粉酶、脂肪酶活性有升高的趨勢，但與對照組差異不顯著。在本試驗中，飼料中添加L-蘋果酸后，湘云鯽腸道淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶以及Na+/K+-ATP酶的活性均不同程度升高，并均在8 g/kg組達到最大值。而當添加水平達到16 g/kg時，除脂肪酶外的腸道其他各酶活性均顯著降低，這與16 g/kg組增重率及飼料效率低于適宜添加組的結果相一致。上述結果說明，飼料中適量添加酸化劑有利于刺激腸壁消化腺的代謝分泌活動，增加消化酶的分泌量，提高消化酶活性，促進消化吸收，從而促進生長;添加過量的酸化劑則可能對消化道表面造成損傷，使魚類處于應激狀態(tài)［25］，生長促進作用顯著降低。

前人關于酸化劑對魚類體組成影響的研究表明，羅非魚飼料中添加 1% ～4%檸檬酸［11］或0.3%的磷酸、富馬酸、乳酸［10］，草魚飼料中添加0.21%的磷酸、檸檬酸、乳酸、復合酸［8］均對魚體組成無顯著影響。但在本試驗中，飼料中添加L-蘋果酸后，湘云鯽魚體水分含量下降，粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量增加，且飼料蛋白質(zhì)、脂肪和灰分沉積率均顯著增加，以飼料灰分和脂肪沉積率的增高最為明顯，這可能與蘋果酸提高礦物質(zhì)的利用［8］和提高肝臟MDH活性有關，MDH活性越高，機體產(chǎn)生的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)越多，從而促進了脂肪的沉積。

動物機體抗氧化能力是衡量機體健康狀態(tài)的重要指標之一，SOD是一類特異性消除超氧自由基的循環(huán)酶，主要負責過氧化和嗜菌作用造成的組織損傷的防御保護作用［26］。機體中MDA的含量反映的是機體脂質(zhì)過氧化的程度，從而反映出細胞損傷程度［27］。尚衛(wèi)敏等［8］在飼料中添加4種不同類型酸化劑后發(fā)現(xiàn)，4種酸化劑均可顯著提高草魚機體的抗氧化能力;張純等［28］研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加200～400 mg/kg綠原酸能顯著增強建鯉的抗氧化能力;吳軍林等［29］發(fā)現(xiàn)，L-蘋果酸能夠顯著改善老年大鼠機體代謝酶的代謝能力，有利于增強肝組織新陳代謝和抗氧化能力。本試驗中，飼料中適量添加L-蘋果酸可顯著提高湘云鯽肝臟中SOD的活性并同時顯著降低MDA的含量，說明L-蘋果酸可提高湘云鯽機體抗氧化能力。其原因可能是L-蘋果酸能使機體保持還原狀態(tài)，為抗氧化酶的還原和再生提供有利的條件，促進機體的能量代謝速率，為大分子蛋白質(zhì)的合成提供能量基礎。

4 結論

①飼料中適量添加L-蘋果酸能夠促進湘云鯽生長，降低飼料系數(shù)，增加魚體營養(yǎng)物質(zhì)沉積，提高消化和抗氧化能力。

②湘云鯽飼料中L-蘋果酸的適宜添加量為4～8 g/kg。

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