彭程遠(yuǎn) 解 俊 金 珊 趙青松 陳寅兒 王國(guó)良

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211)

諾卡氏菌(Nocardia)是一種革蘭氏陽(yáng)性絲狀桿菌，屬于放線菌類微生物，它是水產(chǎn)動(dòng)物諾卡氏菌病的主要致病菌，可引起五條 (Seriola quinqueradiata)、海鱸(Lateolabrax japonicus)、大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)、烏鱧(Channa argus)等多種養(yǎng)殖魚(yú)類的嚴(yán)重死亡［1］。魚(yú)類諾卡氏菌病由于發(fā)生延續(xù)流行時(shí)間長(zhǎng)，從感染至死亡的時(shí)間一般需15 d以上，且早期體表無(wú)明顯癥狀，因此至今還沒(méi)有很好的技術(shù)手段來(lái)預(yù)防和治療該?。?］。

肽聚糖(peptidoglycan，PG)是細(xì)菌細(xì)胞壁的重要組成部分，是一種強(qiáng)免疫增強(qiáng)劑，主要通過(guò)誘導(dǎo)各種免疫調(diào)控物質(zhì)的釋放或表達(dá)來(lái)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫功能［3］。全肽聚糖(whole peptidoglycan，WPG)是指未經(jīng)物理破碎并保持細(xì)菌細(xì)胞壁骨架“袋形”結(jié)構(gòu)完整性的肽聚糖［4］。研究表明，WPG是一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，它在動(dòng)物體內(nèi)體外都能激活免疫細(xì)胞、活化補(bǔ)體并調(diào)節(jié)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫賦活作用，且其免疫活性與其細(xì)胞壁物理形態(tài)的完整程度呈正相關(guān)［5-7］。

魚(yú)類非特異性免疫機(jī)制主要包括細(xì)胞防御和體液防御，其細(xì)胞防御主要是通過(guò)各種血細(xì)胞的吞噬作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而體液防御因子分布于血清、黏液及組織細(xì)胞中，主要有溶菌酶等多種酶、補(bǔ)體、干擾素、凝集素等，它們能非特異性地抑制多種微生物的生長(zhǎng)［8-9］。為了明確WPG對(duì)魚(yú)類非特異性免疫力的調(diào)節(jié)作用，本試驗(yàn)根據(jù)魚(yú)類的免疫特點(diǎn)［9］和其他學(xué)者的研究資料［10-16］篩選出了與魚(yú)類非特異性免疫相關(guān)的檢測(cè)指標(biāo)，研究了 魚(yú)諾卡氏菌(Nocardia seriolae)WPG對(duì)烏鱧黏液、血清及肝臟、腎臟組織中主要非特異性免疫指標(biāo)的影響，以期為魚(yú)類諾卡氏菌病免疫防治尋找新的契機(jī)，為諾卡氏菌亞單位疫苗的研制及免疫增強(qiáng)劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)用烏鱧購(gòu)自寧波市水產(chǎn)市場(chǎng)，體重300～400 g，共250尾，養(yǎng)于室內(nèi)大水族箱中，并用遮陽(yáng)布適當(dāng)遮蓋。根據(jù)水質(zhì)情況每天及時(shí)吸出糞便并用事先曝氣處理的自來(lái)水換水1～2次，每次換水1/3，試驗(yàn)期間連續(xù)充氧，每天投喂魚(yú)體重5%的小雜魚(yú)，早晚各1次。

1.3 樣品的制備

將100尾烏鱧分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10尾。試驗(yàn)組每尾腹腔注射0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的 魚(yú)諾卡氏菌WPG溶液，對(duì)照組同法等量注射0.7%滅菌生理鹽水。于腹腔注射后第 0、1、2、3、4、5、6、7、8 天隨機(jī)從各重復(fù)中取5尾魚(yú)進(jìn)行樣品的采集。首先采集魚(yú)體表黏液，參照陳昌福等［17］的方法進(jìn)行;然后用注射器尾靜脈采血，所采血液分為2份，一份不抗凝，取出后直接放入離心管中4℃靜置2 h后，4℃離心(3 000 r/min)10 min，取上層血清冷藏待測(cè)，另一份用無(wú)菌肝素鈉抗凝，用于血細(xì)胞吞噬指數(shù)(phagocytic index，PI)的測(cè)定;最后無(wú)菌操作解剖魚(yú)取肝臟和頭腎組織，冷藏待測(cè)。

1.4 樣品的處理

1.4.1 黏液的處理［18］

將收集有黏液的Eppendorf管于4℃下3 000 r/min離心，用移液槍槍頭吸掉管底的重力水，稱重記錄數(shù)據(jù)，扣除空Eppendorf管管重(取20個(gè)管的均值)后得黏液凈重，按所得黏液凈重加入9倍重量的滅菌生理鹽水，冰浴勻漿后于4℃離心(10 000 r/min)15 min，取上清液分裝，冷藏待測(cè)。

1.4.2 組織的處理

分別取肝臟和頭腎，經(jīng)滅菌生理鹽水潤(rùn)洗，吸水紙吸去表面水分后稱重，取各組織塊0.2 g，加入9倍重量的滅菌生理鹽水，后續(xù)操作同1.4.1。

1.5 血細(xì)胞吞噬指數(shù)的測(cè)定

取0.3 mL抗凝血，等量加入酵母菌懸液(6.0×108cell/mL)，邊加邊搖，28℃放置45 min，每隔10 min左右搖1次，取出后1 500 r/min離心5 min。棄去上清液后取表層細(xì)胞制成血涂片，自然干燥后甲醇固定5 min，吉姆薩(Giemsa)染色15～20 min，風(fēng)干后油鏡下隨機(jī)觀察50個(gè)參與吞噬的細(xì)胞，記錄吞噬細(xì)胞內(nèi)酵母菌總數(shù)，計(jì)算吞噬指數(shù)。

1.6 血清替代途徑補(bǔ)體活力(alternative complement pathway activity，ACH50)的測(cè)定

ACH50的測(cè)定參照Yano［18］的方法進(jìn)行。先將保存在阿氏液(Alsever’s solution)中的兔紅血細(xì)胞用緩沖液EGTA-Mg2+-GVB緩沖液沖洗3遍后，用該緩沖液將其濃度調(diào)至2.0×108cell/mL，再將待測(cè)血清也用上述緩沖液稀釋20倍備用。取7支離心管，其中1～6號(hào)離心管分別加入0、0.050、0.090、0.125、0.150、0.250 mL EGTA-Mg2+-GVB緩沖液，并加入事先稀釋好的血清，使每支離心管中總體積為0.250 mL;7號(hào)離心管為100%溶血對(duì)照管，僅加入3.400 mL蒸餾水。同時(shí)向每一離心管中加入0.100 mL濃度為2.0×108cell/mL的兔紅血細(xì)胞，20℃溫育90 min，期間不斷搖動(dòng)，反應(yīng)結(jié)束后立即將所有離心管放入冰浴中終止反應(yīng)，然后向1～6號(hào)離心管中加入3.15 mL的生理鹽水。所有離心管在1 600×g下離心5 min，取上清液在414 nm下測(cè)定吸光度(OD)值，以未加血清的6號(hào)離心管作為空白對(duì)照。樣品的溶血度由相應(yīng)的OD值除以100%溶血對(duì)照管的OD值求出Y，以Y/(1-Y)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的血清體積X(mL)為縱坐標(biāo)作圖，將產(chǎn)生50%溶血時(shí)的血清體積記為K。

血清ACH50(unit/mL)=1/K×血清稀釋倍數(shù)。

1.7 酶活力及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

血清、黏液、肝臟及頭腎組織中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和溶菌酶(LSZ)活力及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行。

1.8 魚(yú)諾卡氏菌WPG對(duì)烏鱧的攻毒保護(hù)試驗(yàn)

將150尾烏鱧分為免疫組和對(duì)照組，每組75尾。免疫組每尾腹腔注射0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的 魚(yú)諾卡氏菌WPG溶液，對(duì)照組同法等量注射0.7%滅菌生理鹽水。在免疫后的第7、21、35天，分別從免疫組和對(duì)照組各取20尾魚(yú)用濃度約為3.0×108CFU/mL的 魚(yú)諾卡氏菌菌懸液腹腔注射0.2 mL/尾進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，逐日觀察記錄烏鱧45 d內(nèi)的死亡情況并計(jì)算免疫保護(hù)率。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn):P＞0.05，不存在顯著差異;P＜0.05，存在顯著差異;P＜0.01，存在極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚(yú)諾卡氏菌WPG對(duì)烏鱧血細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響

烏鱧紅細(xì)胞和白細(xì)胞都具有吞噬異物的功能，它們對(duì)酵母菌的吞噬作用分別見(jiàn)圖1和圖2。注射 魚(yú)諾卡氏菌WPG后烏鱧血細(xì)胞吞噬指數(shù)的變化見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組烏鱧紅細(xì)胞和白細(xì)胞吞噬指數(shù)均在注射后第1天就顯著或極顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，在第2天達(dá)峰值，隨后紅細(xì)胞和白細(xì)胞吞噬指數(shù)均逐漸下降，在注射后第3天、第4天紅細(xì)胞吞噬指數(shù)仍顯著或極顯著高于對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)。

圖1 紅細(xì)胞對(duì)酵母菌的吞噬作用Fig.1 Phagocytosis of erythrocytes on yeast(1 000×)

圖2 白細(xì)胞對(duì)酵母菌的吞噬作用Fig.2 Phagocytosis of leukocytes on yeast(1 000×)

2.2 魚(yú)諾卡氏菌WPG對(duì)烏鱧血清ACH50的影響

2.3 魚(yú)諾卡氏菌WPG對(duì)烏鱧不同組織中ACP活力的影響

表1 注射 魚(yú)諾卡氏菌WPG后烏鱧血細(xì)胞吞噬指數(shù)的變化Table 1 The variation of haemocytes phagocytic index of Channa argus after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) %

表2 注射 魚(yú)諾卡氏菌WPG后烏鱧血清ACH50的變化Table 2 The variation of serum ACH50 of Channa argus after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) unit/mL

表3 注射魚(yú)諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中ACP活力的變化Table 3 The variation of ACP activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/dL

表3 注射魚(yú)諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中ACP活力的變化Table 3 The variation of ACP activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/dL

時(shí)間點(diǎn)Time points組織Head kidney第0天 試驗(yàn)組 Experimental group 21.79±2.90 55.20±5.20 398.02±15.53 427.42±20.55 Day 0 對(duì)照組 Control group 22.10±2.57 53.41±5.33 399.35±3.20 428.50±27.68第1天 試驗(yàn)組 Experimental group 28.95±1.90＊＊ 74.87±12.80＊＊ 517.15±19.05＊＊ 510.44±8.71＊＊Day 1 對(duì)照組 Control group 20.91±2.69 52.24±3.49 405.52±10.24 431.27±15.51第2天 試驗(yàn)組Experimental group 24.69±0.89* 87.52±4.24＊＊ 415.56±24.28 464.62±28.03*Day 2 對(duì)照組 Control group 22.29±2.83 51.72±5.36 401.67±6.68 434.96±20.01第3天 試驗(yàn)組 Experimental group 26.66±2.23* 60.14±8.65 406.21±10.57 514.13±26.94*Day 3 對(duì)照組 Control group 22.63±2.40 55.58±8.37 401.42±14.10 446.20±9.38第4天 試驗(yàn)組Experimental group 40.92±1.33＊＊ 57.60±4.48 598.76±28.41＊＊ 474.74±18.50*Day 4 對(duì)照組 Control group 21.41±2.30 50.12±2.21 399.91±16.70 422.45±25.24第5天 試驗(yàn)組Experimental group 30.63±1.74＊＊ 58.27±6.02 402.31±12.66 452.47±11.36 Day 5 對(duì)照組 Control group 20.89±1.02 50.47±3.29 390.23±30.95 437.47±10.67第6天 試驗(yàn)組Experimental group 32.08±2.31＊＊ 52.19±5.56 443.30±31.52* 504.53±15.32＊＊Day 6 對(duì)照組 Control group 21.75±1.96 49.55±7.40 400.89±15.37 433.22±19.84第7天 試驗(yàn)組 Experimental group 31.14±2.39* 57.03±1.78 424.07±15.84 541.66±22.56＊＊Day 7 對(duì)照組 Control group 22.09±2.44 51.08±5.93 401.54±20.52 425.73±16.71第8天 試驗(yàn)組 Experimental group 31.81±2.92* 58.27±5.12 404.76±22.90 487.25±33.15*Day 8 對(duì)照組 Control group 22.31±3.36 51.68±9.01 391.00±16.64 437.97±3.50組別Groups Tissues血清Serum 黏液Mucus 肝臟Liver 頭腎

表4 注射魚(yú)諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中AKP活力的變化Table 4 The variation of AKP activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) 金氏單位/dL

表4 注射魚(yú)諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中AKP活力的變化Table 4 The variation of AKP activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) 金氏單位/dL

時(shí)間點(diǎn)Time points組織Head kidney第0天 試驗(yàn)組 Experimental group 7.10±1.35 51.67±2.54 205組別Groups Tissues血清Serum 黏液Mucus 肝臟Liver 頭腎.44±8.67 468.36±28.56 Day 0 對(duì)照組 Control group 7.00±2.52 52.43±1.21 203.17±8.25 469.64±27.02第1天 試驗(yàn)組 Experimental group 7.99±1.96 50.78±6.92 209.63±16.86 490.15±26.49 Day 1 對(duì)照組 Control group 6.67±1.12 48.47±6.68 206.05±10.22 462.79±20.06第2天 試驗(yàn)組 Experimental group 8.53±2.12 47.84±2.75 210.08±29.05 468.23±24.95 Day 2 對(duì)照組 Control group 7.28±2.81 46.31±4.63 204.73±19.67 462.08±28.81第3天 試驗(yàn)組 Experimental group 8.10±1.30 47.47±8.17 241.81±25.80* 474.54±25.43 Day 3 對(duì)照組 Control group 7.72±0.97 50.27±11.03 202.42±11.42 464.97±26.95第4天 試驗(yàn)組Experimental group 9.33±0.98* 56.23±2.80 264.13±24.73＊＊ 471.25±26.01 Day 4 對(duì)照組 Control group 7.95±1.82 53.68±1.61 200.52±21.77 474.90±23.72第5天 試驗(yàn)組 Experimental group 8.12±1.24* 50.24±3.71 203.03±11.85 478.49±26.84 Day 5 對(duì)照組 Control group 7.56±0.75 48.83±3.05 200.97±13.69 475.43±27.33第6天 試驗(yàn)組Experimental group 16.16±1.98＊＊ 49.22±12.62 219.39±21.31 469.52±24.65 Day 6 對(duì)照組 Control group 8.45±1.19 51.27±9.22 198.50±23.74 469.16±18.27第7天 試驗(yàn)組 Experimental group 9.60±0.41* 50.31±3.72 205.38±15.26 475.21±22.11 Day 7 對(duì)照組 Control group 8.15±1.12 46.23±11.32 191.18±28.60 475.08±22.22第8天 試驗(yàn)組 Experimental group 9.51±0.32 48.95±7.88 192.43±20.60 480.79±7.53 Day 8 對(duì)照組 Control group 8.90±1.72 50.32±6.66 191.27±16.55 468.65±26.52

表5 注射魚(yú)諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中SOD活力的變化Table 5 The variation of SOD activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/mL

表5 注射魚(yú)諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中SOD活力的變化Table 5 The variation of SOD activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/mL

時(shí)間點(diǎn)Time points組織Head kidney第0天 試驗(yàn)組 Experimental group 108.82±17.65 20.18±3.48組別Groups Tissues血清Serum 黏液Mucus 肝臟Liver 頭腎13.26±1.52 6.42±1.45 Day 0 對(duì)照組 Control group 107.96±17.66 20.76±1.20 13.56±1.64 6.38±0.80第1天 試驗(yàn)組 Experimental group 136.53±14.45* 23.33±2.79* 14.81±1.90 7.39±1.29 Day 1 對(duì)照組 Control group 103.00±10.62 20.17±2.03 14.13±1.42 7.15±1.00第2天 試驗(yàn)組Experimental group 152.35±6.37＊＊ 28.91±1.28＊＊ 13.93±1.23 7.54±1.50 Day 2 對(duì)照組 Control group 110.29±2.68 20.61±2.55 12.75±1.82 7.22±1.51第3天 試驗(yàn)組Experimental group 144.92±16.35＊＊ 26.17±0.86＊＊ 13.06±2.39 7.46±1.17 Day 3 對(duì)照組 Control group 105.00±13.53 19.44±1.01 13.05±0.15 7.01±1.82第4天 試驗(yàn)組Experimental group 184.00±24.20＊＊ 26.87±0.54＊＊ 14.40±1.87 6.77±0.86 Day 4 對(duì)照組 Control group 105.42±24.05 18.76±2.56 12.24±1.26 6.52±1.26第5天 試驗(yàn)組Experimental group 139.44±5.96＊＊ 27.95±3.01＊＊ 13.56±1.38 6.89±0.77 Day 5 對(duì)照組 Control group 108.91±14.68 20.60±3.22 12.31±2.35 7.07±1.80第6天 試驗(yàn)組 Experimental group 135.51±7.25* 22.99±1.01* 14.12±1.16 6.74±1.91 Day 6 對(duì)照組 Control group 117.65±21.77 18.24±2.02 14.45±0.39 6.20±0.69第7天 試驗(yàn)組Experimental group 140.17±16.23＊＊ 23.25±3.23* 13.37±3.53 6.91±1.38 Day 7 對(duì)照組 Control group 100.53±14.19 20.42±2.66 13.15±2.58 6.91±0.42第8天 試驗(yàn)組Experimental group 120.95±3.27 26.37±0.69＊＊ 14.09±2.90 6.66±1.56 Day 8 對(duì)照組 Control group 106.13±15.11 20.26±3.25 13.79±2.98 6.61±1.07

2.6 魚(yú)諾卡氏菌WPG對(duì)烏鱧不同組織中LSZ活力的影響

2.7 魚(yú)諾卡氏菌WPG對(duì)烏鱧的免疫保護(hù)效應(yīng)

3 討論

魚(yú)類屬于低等脊椎動(dòng)物，其非特異性體液免疫因子和吞噬細(xì)胞在機(jī)體的免疫防御過(guò)程中起著主導(dǎo)的作用［8］。有研究表明，魚(yú)類除了白細(xì)胞外，其紅細(xì)胞也具有吞噬功能［19-21］，這在本試驗(yàn)中也得到了證實(shí)(圖1)。王旭東等［21］認(rèn)為這主要是因?yàn)榧t細(xì)胞和白細(xì)胞都來(lái)源于造血干細(xì)胞，即使后來(lái)由于細(xì)胞的分化使白細(xì)胞獲得了各種免疫防御機(jī)能，而紅細(xì)胞則成為攜帶氧和調(diào)節(jié)體液酸堿和離子平衡者，但紅細(xì)胞仍保持了對(duì)異物的黏附和吞噬的免疫功能，這可能與它們細(xì)胞膜中含有糖基磷脂酰肌醇有關(guān)，且紅細(xì)胞的黏附和吞噬功能在低等動(dòng)物中更加明顯。本試驗(yàn)結(jié)果顯示， 魚(yú)諾卡氏菌WPG可以較快地刺激烏鱧紅細(xì)胞和白細(xì)胞的吞噬能力，且對(duì)紅細(xì)胞吞噬能力的促進(jìn)更大，這與溫安祥等［22］的研究結(jié)果類似。

魚(yú)類補(bǔ)體直接參與機(jī)體防御，其生物學(xué)活性影響機(jī)體抵抗微生物的能力、免疫反應(yīng)細(xì)胞間的通訊聯(lián)系、免疫復(fù)合物的形成和持續(xù)時(shí)間等，而ACH50是衡量魚(yú)類非特異性免疫力的一項(xiàng)重要指標(biāo)［23］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射 魚(yú)諾卡氏菌WPG后第1天烏鱧的血清ACH50就極顯著升高，在注射后的4 d內(nèi)均顯著高于對(duì)照組，這與張璐等［10］、張春曉等［11］、周進(jìn)等［24］的研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明 魚(yú)諾卡氏菌WPG具有激活魚(yú)類補(bǔ)體系統(tǒng)的作用。

表6 注射 魚(yú)諾卡氏菌WPG后烏鱧不同組織中LSZ活力的變化Table 6 The variation of LSZ activity in different tissues of Channa argu after injection with WPG from Nocardia seriolae(n=5) U/mL

表7 魚(yú)諾卡氏菌WPG對(duì)烏鱧的免疫保護(hù)效應(yīng)Table 7 Immune protective efficacy of WPG from Nocardia seriolae on Channa argu

ACP主要存在于肝臟、腎臟、血液、骨骼等組織中，是溶酶體的標(biāo)志酶;AKP主要存在于骨骼、肝臟和血液中，可催化有機(jī)磷酸酯水解，通過(guò)改變細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)增強(qiáng)其異己性，從而被免疫細(xì)胞識(shí)別達(dá)到免疫防御的作用［12，25］，它們都是動(dòng)物體內(nèi)參與免疫防御的重要水解酶，可作為衡量動(dòng)物體非特異性免疫力的指標(biāo)［9］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組烏鱧ACP活力肝臟＞腎臟＞黏液，AKP活力腎臟＞肝臟＞黏液，這與周進(jìn)等［13］的研究結(jié)果相似;而 魚(yú)諾卡氏菌WPG能顯著提高烏鱧血清、頭腎、肝臟、黏液中ACP活力及血清、肝臟中AKP活力，但對(duì)頭腎和黏液中AKP活力沒(méi)有顯著影響，作者認(rèn)為這可能與ACP和AKP的功能及它們與不同組織的親和性等有關(guān)。關(guān)于表3中部分組織ACP活力出現(xiàn)多峰的現(xiàn)象，作者推測(cè)一方面魚(yú)諾卡氏菌WPG作為已知的病原模式分子進(jìn)入魚(yú)體后可以激活肽聚糖結(jié)合蛋白等模式識(shí)別受體，從而引起多種免疫應(yīng)答反應(yīng)，包括ACP的產(chǎn)生和激活［26］;另一方面ACP是溶酶體中的主要水解酶，而溶酶體具有防御和消化的雙重功能， 魚(yú)諾卡氏菌WPG作為機(jī)體的異物，在它完成免疫調(diào)節(jié)作用后必須被消化清除，因而造成了ACP活力的又一次增強(qiáng);此外，由于魚(yú)類是變溫動(dòng)物，外界環(huán)境因素及試驗(yàn)操作都有可能影響其組織中酶的活力，但這些均還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。

SOD主要是清除動(dòng)物體液或組織中的超氧基，在防御細(xì)胞組織超氧陰離子()毒性、生物分子損傷方面起著十分重要的作用［14］。周進(jìn)等［16］研究表明，牙鲆組織中SOD活力黏液 ＞肝臟＞腎臟，投喂肽聚糖后對(duì)肝臟、腎臟、血清中SOD活力沒(méi)有顯著影響，而不同的投喂方式對(duì)黏液中SOD活力有顯著影響;宋曉玲等［15］的研究發(fā)現(xiàn)，肽聚糖能適當(dāng)提高日本對(duì)蝦血清中SOD活力，但影響不顯著。本研究結(jié)果顯示，烏鱧在注射魚(yú)諾卡氏菌WPG后肝臟和頭腎中SOD活力無(wú)顯著變化，而血清和黏液中SOD活力均有所升高，作者認(rèn)為這與SOD的功能有關(guān)，因?yàn)轲ひ菏菣C(jī)體免疫保護(hù)的第1道屏障，而血液可以進(jìn)入機(jī)體的各個(gè)組織和器官，因此血清和黏液中SOD活力的升高說(shuō)明 魚(yú)諾卡氏菌WPG可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)有毒物質(zhì)清除的加強(qiáng)，提高機(jī)體免疫力［16］。

LSZ由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞等產(chǎn)生，主要存在于動(dòng)物的分泌液和血清中，在機(jī)體抵抗病原微生物的防御中起著重要作用［27］。本研究結(jié)果表明，烏鱧LSZ活力血清＞頭腎＞肝臟＞黏液，而注射 魚(yú)諾卡氏菌WPG后烏鱧各組織中LSZ活力都發(fā)生了明顯的變化，尤其是黏液、血清和肝臟，其LSZ活力在一定時(shí)間內(nèi)升高極顯著，但變化趨勢(shì)不盡相同，這與張璐等［10］、張春曉等［11］和宋曉玲等［15］的研究結(jié)果基本相同。Di Luzio［28］認(rèn)為免疫多糖可以促進(jìn)單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的增生，激活它們分泌LSZ。由于本試驗(yàn)是采用腹腔注射免疫的方法，因此作者推測(cè)當(dāng)注射 魚(yú)諾卡氏菌WPG后烏鱧血液和肝臟組織中的巨噬細(xì)胞等首先被激活并進(jìn)行增生和分泌LSZ，黏液中LSZ主要是魚(yú)體應(yīng)激分泌產(chǎn)生，而 魚(yú)諾卡氏菌WPG對(duì)頭腎的作用相對(duì)稍晚，短時(shí)間內(nèi)主要是促進(jìn)免疫細(xì)胞的增生和分化，因此頭腎中LSZ活力上調(diào)沒(méi)有黏液、血清和肝臟等組織明顯。

4 結(jié)論

［1］袁思平，王國(guó)良，金珊.養(yǎng)殖魚(yú)類致病諾卡氏菌研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2006，33(2):137-141.

［2］徐益軍.養(yǎng)殖烏鱧諾卡氏菌病的病原與致病機(jī)理［D］.碩士學(xué)位論文.寧波:寧波大學(xué)，2008:12-29.

［3］王靜華，趙洪濤，汪以真.細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)獸藥雜志，2004，38(1):38-40.

［4］SEKINE K，TOIDA T，SAITO M，et al.A new morphologically characterized cell wall preparation(whole peptidoglycan)from Bifidobacterium infantis with a higher efficacy on the regression of an established tumor in mice［J］.Cancer Research，1985，45:1300-1307.

［5］丁喜順.長(zhǎng)雙歧桿菌細(xì)胞壁完整肽聚糖分離及其免疫、抑瘤活性的研究［D］.碩士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009:7-38.

［6］SEKINE K，OHTA J，PNISHI M，et al.Analysis of antitumor properties of effector cells stimulated with a cell wall preparation(WPG)of Bifidobacterium infantis［J］.Biological＆ Pharmaceutical Bulletin，1995，18:148-153.

［7］PICARD C，F(xiàn)IORAMONTI J，F(xiàn)RANCOIS A，et al.Review article:bifidobacteria as probiotic agents-physiological effects and clinical benefits［J］.Alimentary Pharmacology Therapeutics，2005，22(3):495-512.

［8］TANG M，MA G Z，XU J.Advances in research of fish immunology［J］.Journal of Immunology，2002，18(3):112-116.

［9］肖克宇，鄧時(shí)銘，向建國(guó)，等.水產(chǎn)動(dòng)物免疫與應(yīng)用［M］.北京:科學(xué)出版社，2007:16-30.

［10］張璐，艾慶輝，麥康森，等.肽聚糖對(duì)鱸魚(yú)生長(zhǎng)和非特異性免疫力的影響［J］.中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，38(4):551-556.

［11］張春曉，麥康森，艾慶輝，等.飼料中添加肽聚糖對(duì)大黃魚(yú)生長(zhǎng)和非特異性免疫力的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2008，32(3):411-416.

［12］劉樹(shù)青，江曉路，牟海津，等.免疫多糖對(duì)中國(guó)對(duì)蝦血清溶菌酶、磷酸酶和過(guò)氧化物酶的作用［J］.海洋與湖沼，1999，30(3):278-283.

［13］周進(jìn)，宋曉玲，陳國(guó)福，等.A3α-肽聚糖不同投喂方式下牙鲆及組織中相關(guān)酶的變化［J］.飼料工業(yè)，2006，27(2):5-9.

［14］李敬璽，劉繼蘭，王選年，等.超氧化物歧化酶研究和應(yīng)用進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28(7):70-75.

［15］宋曉玲，楊旭彤，偲瀚文，等.雙歧桿菌細(xì)胞壁肽聚糖的分離及其對(duì)二種海產(chǎn)動(dòng)物免疫活性的影響［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2005，29(3):350-355.

［16］周進(jìn)，宋曉玲，黃倢，等.A3α-肽聚糖對(duì)牙鲆不同組織中超氧化物歧化酶及磷酸酶活性的影響［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2004，11(4):296-301.

［17］陳昌福，羅宇良，蔡冰，等.實(shí)驗(yàn)水溫對(duì)草魚(yú)溶菌酶活性的影響［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，1996，3(3):24-30.

［18］YANO T.Assays of hemolytic complement activity［J］.Techniques in Fish Immunology，1992，43:131-141.

［19］蔡完其，軒興榮.紅鯉4群體間紅細(xì)胞免疫功能及差異［J］.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2003，10(2):133-136.

［20］周賢君，代應(yīng)貴，王開(kāi)功，等.低等脊椎動(dòng)物血細(xì)胞研究概況［J］.水利漁業(yè)，2008，28(2):9-12.

［21］王旭東，饒家榮.紅細(xì)胞廣泛吞噬作用的發(fā)現(xiàn)和研究［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1996，20(1):72-75.

［22］溫安祥，張遼.β-(1，3)-葡聚糖對(duì)齊口裂腹魚(yú)非特異性免疫功能的影響［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，28(3):361-365.

［23］王志平，張士璀，王光鋒.魚(yú)類補(bǔ)體系統(tǒng)成分及補(bǔ)體特異性和功能的研究進(jìn)展［J］.水生生物學(xué)報(bào)，2008，32(5):760-769.

［24］周進(jìn)，宋曉玲，黃倢，等.牙鲆口服A3α-肽聚糖最佳投喂方案的選擇［J］.海洋水產(chǎn)研究，2005，26(4):19-25.

［25］朱忠勇.實(shí)用醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，1997.

［26］趙蕾，張克英，丁雪梅.肽聚糖在非特異性免疫中的信號(hào)作用［J］.飼料工業(yè)，2008，29(2):45-47.

［27］ENGSTAD R E，ROBRTESEN B，F(xiàn)RIVOLD E.Yeast glucan induces increase in activity of lysozyme and complement-mediated haemolytic activity in Atlantic salmon blood［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，1992(2):287-297.

［28］DI LUZIO N R.Lysozyme，glucan-antivated macrophages and neoplasia［J］.Journal of the Reticuloendothelial Society，1979，26:67-81.