顧 燕，孫文婷，鄧勝利，張 琳，田 偉

(遵義醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)系，貴州遵義 563099)

線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的特異性標(biāo)志，同時也是早期細(xì)胞凋亡不可逆的事件。以往研究證實(shí)，通過開放線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)可以抑制線粒體膜電位的下降［1］。UrocortinⅠ(UcnⅠ)是一種由40個氨基酸殘基構(gòu)成的新型神經(jīng)肽。近期研究發(fā)現(xiàn)，UcnⅠ具有一定的心肌保護(hù)效應(yīng)［2］，但這一保護(hù)效應(yīng)與MMP及MPP的變化與UcnⅠ和mitoKATP之間存在怎么樣的關(guān)系尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過激光共聚焦顯微鏡觀察UcnⅠ預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧后大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響，來進(jìn)一步闡明UcnⅠ抗心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 250 g左右SPF級健康雄性Sprague Dawley大鼠30只，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號:SCXK(渝)2012－0005。

1.2 主要試劑及儀器 UrocortinⅠ、5－羥葵酸、M199、Ⅱ型膠原酶、層黏連蛋白、EGTA、BSA均購自(美國，Sigma公司);JC－1線粒體膜電位檢測試劑盒(中國，江蘇碧云天生物研究所)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。SP2型激光共聚焦顯微鏡(德國，萊卡公司)，全自動數(shù)碼成像與分析系統(tǒng)(美國，GenGenius，Syngene)，MPA 離體心臟灌注裝置系列(中國，北京吉安得爾科技有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國，F(xiàn)orma公司)，倒置相差顯微鏡為OLYMPUS CK2公司、純水處理器(美國，Millipore)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理 成年大鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［3］，將培養(yǎng)24 h后的心肌細(xì)胞隨機(jī)分成4組:正常組(Nor組):37℃95%O2+5%CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)155 min;缺氧/復(fù)氧組(I/R組):37℃95%O2+5%CO2正常培養(yǎng)55 min后，在37℃95%N2+5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧40 min，再復(fù)氧60 min;UrocortinⅠ組(UcnⅠ組):正常培養(yǎng)25 min后用終濃度10－8mol/L的UcnⅠ處理30 min，缺氧40 min，再復(fù)氧60 min;5－羥奎酸+UrocortinⅠ組(5－HD+UconⅠ組):正常培養(yǎng)20 min后先用終濃度100 umol/L的5－HD處理5 min后，余處理同UcnⅠ組。各組于復(fù)氧末行激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位。

1.4 激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位 室溫避光條件下，按照J(rèn)C－1膜電位檢測試劑盒說明配置JC－1染色工作液。吸除細(xì)胞培養(yǎng)基，另加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基及1 mLJC－1染色工作液，放置37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育期間，用去離子水將5倍濃度的JC－1染色緩沖液按照比4∶1比例稀釋，并放置37℃水浴箱中預(yù)熱。孵育結(jié)束后，吸除上清液，用1倍濃度的JC－1染色緩沖液洗滌4次，加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，激光共聚焦顯微鏡觀察心肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度。在線粒體膜電位較低時，JC－1在線粒體基質(zhì)中為單體(monomer)形式，產(chǎn)生綠色熒光;在線粒體膜電位較高時，JC－1在線粒體基質(zhì)中形成聚合物(J－aggregates)，則產(chǎn)生紅色熒光;常用紅、綠熒光的相對比值來衡量線粒體膜電位的高低。(圖像采集及觀察采用單盲法隨機(jī)選擇8個不同視野內(nèi)的30個心肌細(xì)胞觀察紅、綠熒光強(qiáng)度)

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成年大鼠心肌細(xì)胞分離結(jié)果 顯微鏡下可見新分離的心肌細(xì)胞呈桿狀或矩形，橫紋肌清晰可見，細(xì)胞厚實(shí)，細(xì)胞一端可呈階梯狀(見圖1)。10%～15%的心肌細(xì)胞發(fā)生自發(fā)性收縮活動，節(jié)律為5～20次/min不等，其余細(xì)胞呈靜息狀態(tài)。

2.2 激光共聚焦顯微鏡下各組心肌細(xì)胞膜電位熒光圖見圖2，其熒光值結(jié)果顯示:Nor組心肌細(xì)胞線粒體膜電位較高(P＜0.01)，I/R組線粒體膜電位與Nor組相比顯著下降(P＜0.01);而UcnⅠ組線粒體膜電位明顯高于I/R組和5－HD+UcnⅠ組(P ＜0.01，見表 1)。

圖1 新分離成年大鼠心肌細(xì)胞

圖2 激光共聚焦顯微鏡下心肌細(xì)胞線粒體膜電位熒光圖(×400倍)

表1 缺氧/復(fù)氧后各組心肌細(xì)胞線粒體膜電位熒光值比較(n=30，±s)

表1 缺氧/復(fù)氧后各組心肌細(xì)胞線粒體膜電位熒光值比較(n=30，±s)

注:與 Nor組比較，*P＜0.01;與 I/R 組比較，#P＜0.01;與 UcnⅠ組比較△P ＜0.01。

1.67 ±0.06 I/R 組 0.76 ±0.08*UcnⅠ組 1.10 ±0.07#5 －HD+UconⅠ組 0.71 ±0.06組別 線粒體膜電位Nor組＊△

3 討論

心肌缺血再灌注損傷(Ischemia Reperfusion Injury，IRI)是指心肌在遭受一段時間的缺血、缺氧后，恢復(fù)血液灌注時，受損的心肌不但不能恢復(fù)甚至發(fā)生更為嚴(yán)重不可逆的損害。早在1999年Kohli V等的研究已經(jīng)證實(shí)，細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷的重要原因之一［4］。細(xì)胞可以通過兩條獨(dú)立的途徑發(fā)生凋亡。一條是通過死亡受體即外源性途徑，而另一條則是由線粒體啟動的內(nèi)源凋亡程序。目前認(rèn)為線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路是導(dǎo)致IRI的主要途徑［5］，而線粒體膜電位的改變與其密切相關(guān)。線粒體膜電位主要是在氧化呼吸過程中由位于線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子泵將基質(zhì)內(nèi)的質(zhì)子泵入膜間隙，形成質(zhì)子梯度，使線粒體內(nèi)膜兩側(cè)發(fā)生變化，即:線粒體基質(zhì)中產(chǎn)生負(fù)電荷，而線粒體膜間隙中產(chǎn)生正電荷，使內(nèi)外膜兩側(cè)形成電位差，呈現(xiàn)內(nèi)負(fù)，外正狀態(tài)。正常線粒體的膜電位是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化，產(chǎn)生ATP的先決條件，是保持線粒體功能所必需的［6］。

本研究通過激光共聚焦顯微鏡檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn):UcnⅠ組線粒體膜電位明顯高于I/R組，但低于Nor組，說明UcnⅠ預(yù)處理可以穩(wěn)定心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后線粒體膜電位，這可能是UcnⅠ產(chǎn)生心肌保護(hù)作用的原因之一。既往有研究報(bào)道，UcnⅠ預(yù)處理可以上調(diào)線粒體敏感性鉀通道亞單位Kir6.1的基因表達(dá)，而大量研究已經(jīng)證實(shí)線粒體敏感性鉀通道是抗心肌缺血再灌注損傷的終末效應(yīng)器［7］。為了進(jìn)一步研究UcnⅠ穩(wěn)定線粒體的膜電位是否與開放線粒體敏感性鉀通道有關(guān)，本研究選擇了特異性線粒體敏感性鉀通道阻斷劑5－羥葵酸，結(jié)果顯示，5－羥葵酸阻斷了UcnⅠ對線粒體膜電位的穩(wěn)定作用。因此，我們推測UcnⅠ預(yù)處理對線粒體膜電位的穩(wěn)定作用是與線粒體敏感性鉀通道的開放有關(guān)其可能的機(jī)制是:UcnⅠ通過激活線粒體敏感性鉀通道，增加鉀離子外流，抑制電壓依賴性鈣通道的鈣離子內(nèi)流，加速鈉離子和鈣離子交換促進(jìn)線粒體內(nèi)鈣離子的釋放，減輕線粒體鈣超載，恢復(fù)線粒體內(nèi)膜質(zhì)子跨膜潛能，使膜電位去極化，逆轉(zhuǎn)線粒體通透性轉(zhuǎn)孔的開放，減少CytoC等膜間蛋白釋放入胞質(zhì)，抑制了caspase－3級聯(lián)反應(yīng)，阻止細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)缺氧心肌細(xì)胞功能的恢復(fù)［8－9］。Rutka等［10］研究同樣證明了，細(xì)胞在不同因子作用下發(fā)生凋亡時伴有線粒體膜電位的下降，如果能穩(wěn)定線粒體膜電位，不但可以阻止凋亡的進(jìn)展而且可以防止細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)支持這一理論，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，UcnⅠ預(yù)處理可以穩(wěn)定成年大鼠缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞線粒體膜電位，產(chǎn)生心肌保護(hù)作用，其機(jī)制可能與開放線粒體敏感性鉀通道有關(guān)。

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