齊希光，李秀芬

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

僅2010年，我國就產(chǎn)生了約470萬t的醬渣（含水75%）。醬渣是指釀造醬油原料經(jīng)制曲、發(fā)酵、淋出醬油后產(chǎn)生的固體殘渣。據(jù)釀造原料不同，醬渣（干基）中含有約20%～30%粗蛋白、7%～18%粗脂肪、10%以上碳水化合物、20%～24%粗纖維、8%～12%水分、0.5%～2.0%鹽分和豐富的礦物質(zhì)，再利用價值很高。目前，醬渣主要是低價賣給農(nóng)民用作肥料和飼料，但由于含鹽度高，用量受到限制[1]。而其回收利用和深度加工尚處于研究階段，主要集中在提取油脂、膳食纖維、黃酮和鮮味劑等成分，研究結(jié)果尚不理想。

有機(jī)廢棄物厭氧發(fā)酵會產(chǎn)生多種揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）如乙酸、丁酸等，可作為發(fā)酵工業(yè)原料生產(chǎn)高附加值的發(fā)酵產(chǎn)品（如角質(zhì)酶）[2-3]，或作為化工原料合成其他產(chǎn)品[4]，或作為微生物燃料電池的底物產(chǎn)電[5-6]，或用于廢水脫氮除磷[7-8]。VFA的附加值遠(yuǎn)大于甲烷，據(jù)MICHAEL KR[9]估測，1t生物質(zhì)可以生產(chǎn)價值150美元的乙酸，但只能生產(chǎn)出價值31美元的甲烷[9]。發(fā)酵時間是厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的重要參數(shù)之一。首先，厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸是一個三階段過程，隨著發(fā)酵時間的推進(jìn)，產(chǎn)物會不斷轉(zhuǎn)化，戊酸、丁酸、丙酸等可能會轉(zhuǎn)化成乙酸，但乙酸也可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為H2、CH4、CO2等；其次，產(chǎn)物的過度積累可能會產(chǎn)生反饋抑制，吉布斯自由能降低，反應(yīng)不再向正方向發(fā)生；最后，厭氧微生物生長繁殖也遵循生長曲線的3個階段[10]：對數(shù)生長階段、穩(wěn)定生長階段、內(nèi)源呼吸階段。

目前，生物質(zhì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的研究主要集中在污水處理廠污泥、餐廚垃圾、藍(lán)藻等的處理，而有關(guān)醬渣厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸研究報道鮮見。通過優(yōu)化醬渣厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的發(fā)酵時間，將醬渣中的有機(jī)成分盡可能多的轉(zhuǎn)化成乙酸等揮發(fā)性脂肪酸，可在實現(xiàn)醬渣減量化的同時，生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，是獲得良好環(huán)境和經(jīng)濟(jì)效益的有效途徑。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

醬渣溶液濃度為100g/L，用4mol/LHCl和NaOH調(diào)節(jié)pH值至11.0，90℃預(yù)處理2h，離心后的上清液作為發(fā)酵產(chǎn)酸的底物，其中，可溶性蛋白質(zhì)和碳水化合物的濃度分別為3.5g/L～5.0g/L和3.0g/L～4.0g/L。接種污泥為無錫市某污水處理廠的消化污泥，其有機(jī)物和總固體之比（VS/TS）為62.90%。將此污泥放入有效容積為2L的UASB反應(yīng)器中馴化[11]，所得酸化接種污泥的VS/TS為71.21%。初始發(fā)酵pH值為9.0，發(fā)酵基質(zhì)與微生物之比（F/M）比為5∶1。充3min氮?dú)夂笙鹉z塞密封，放入120r/min搖床中厭氧發(fā)酵[12-13]，發(fā)酵溫度為35℃。

1.2 儀器與設(shè)備

2010 氣相色譜儀：日本島津公司；T6紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FE20pH計：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；CR21GII高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；HZ-2011KC汽浴搖床：太倉市華利達(dá)實驗設(shè)備有限公司；UASB反應(yīng)器：自制。

1.3 分析測試項目及方法

測定前樣品預(yù)處理：取5mL厭氧產(chǎn)酸發(fā)酵液，8000r/min離心5min，用0.45μm的微濾膜過濾，取濾液0.5mL于離心管中，加入同體積0.835g/L的4-甲基戊酸溶液（作為內(nèi)標(biāo)）和同體積3mol/L的磷酸溶液（促使溶液中的VFA在進(jìn)樣室內(nèi)氣化），混勻，再次8000r/min離心5min，取1mL上清液裝入氣相色譜進(jìn)樣瓶，進(jìn)島津2010氣相色譜儀檢測。氣相色譜測定參數(shù)：AOC-20i自動進(jìn)樣器；FID檢測器；PEG-20M毛細(xì)管柱（30m×0.32mm×0.5μm）：大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；采用一階程序升溫，初溫80℃，保持3min后，以15℃/min的速率升至210℃，保持2min。進(jìn)樣室和檢測器的溫度都設(shè)為250℃。

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G250染色法測定[14]；碳水化合物含量采用苯酚-硫酸法測定[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵時間對可溶性蛋白質(zhì)濃度的影響

醬渣中含有占總固體20%～30%的粗蛋白，也是其預(yù)處理液中厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的重要底物，約為3.5g/L～5.0g/L，考察發(fā)酵前后蛋白質(zhì)濃度的變化非常重要。發(fā)酵初期，底物與微生物發(fā)酵接觸作用時間較短，底物的利用和轉(zhuǎn)化率低，隨發(fā)酵時間延長，微生物與底物的接觸更為充分，有利于底物的代謝降解，相應(yīng)地底物轉(zhuǎn)化率增大。醬渣預(yù)處理液中蛋白質(zhì)濃度隨發(fā)酵時間的變化情況見圖1。

由圖1可見，蛋白質(zhì)濃度隨發(fā)酵時間的延長先快速下降，后基本穩(wěn)定。發(fā)酵初期，醬渣預(yù)處理液中蛋白質(zhì)濃度較高，約為3.5g/L，與微生物接觸并吸收轉(zhuǎn)化的幾率大，蛋白質(zhì)降解迅速，發(fā)酵2d時，蛋白質(zhì)濃度就降低至1.2g/L左右，蛋白質(zhì)降解率達(dá)62.52%。之后，隨蛋白質(zhì)濃度的降低，與微生物接觸并吸收轉(zhuǎn)化的幾率隨之下降，降解速度逐漸平穩(wěn)，發(fā)酵至第8d時，蛋白質(zhì)降解率為68.60%。發(fā)酵8d后，延長發(fā)酵時間對蛋白質(zhì)降解轉(zhuǎn)化的意義不大。

圖1 發(fā)酵時間對蛋白質(zhì)濃度的影響Fig.1 Influence of fermentation time on protein concentration

2.2 發(fā)酵時間對可溶性碳水化合物濃度的影響

醬渣中碳水化合物的含量在10%以上，其醬渣預(yù)處理液中的濃度約為3.0g/L～4.0g/L，相對而言，又易被微生物吸收利用，是厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的良好底物?？扇苄蕴妓衔餄舛入S發(fā)酵時間的變化規(guī)律見圖2。

圖2 發(fā)酵時間對碳水化合物濃度的影響Fig.2 Influence of fermentation time on carbohydrate concentration

由圖2可見，與醬渣中蛋白質(zhì)濃度的變化類似，隨發(fā)酵時間的延長，碳水化合物濃度同樣是先迅速降低，再呈平穩(wěn)下降的趨勢。在發(fā)酵初期，因可溶性碳水化合物濃度高，易與微生物接觸并消化吸收，降解迅速，其濃度在2d內(nèi)由2.90g/L降低為0.90g/L，碳水化合物濃度下降迅速，其降解率達(dá)68.33%。之后濃度趨于平穩(wěn)，發(fā)酵至第8d時，碳水化合物降解率為81.21%，之后，降低不明顯。另外，碳水化合物比蛋白質(zhì)更易被產(chǎn)酸微生物降解利用，在相同條件下，其轉(zhuǎn)化率比蛋白質(zhì)高出約10個百分點(diǎn)，高濃度的可溶性碳水化合物有利于厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸。

2.3 發(fā)酵時間對厭氧發(fā)酵末端產(chǎn)物濃度的影響

厭氧發(fā)酵末端產(chǎn)物的分布主要取決于各個生態(tài)因子綜合作用下占主導(dǎo)地位的微生物種群的獨(dú)立代謝途徑，即一旦環(huán)境條件適于某一種群，該種群就會迅速占據(jù)主導(dǎo)地位，其生理代謝就決定了發(fā)酵末端產(chǎn)物的類型[16]。VFA是酸化階段的主要產(chǎn)物，乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸可直接由碳水化合物及蛋白質(zhì)發(fā)酵獲得，更高分子量的揮發(fā)性脂肪酸，如正戊酸和異戊酸等主要由蛋白質(zhì)發(fā)酵獲得，因為對不含蛋白質(zhì)的底物進(jìn)行酸化研究發(fā)現(xiàn)，不生成正戊酸和異戊酸。醬渣預(yù)處理液厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸分布隨發(fā)酵時間的變化情況見圖3。可以看出，末端發(fā)酵產(chǎn)物分布隨發(fā)酵時間的延長先增加后降低，發(fā)酵產(chǎn)物包括乙醇、乙酸、丙酸、異丁酸、正丁酸、戊酸等。發(fā)酵至第8d時，總發(fā)酵末端產(chǎn)物濃度最高，為28.82g/L，相應(yīng)地，乙酸濃度也在此時達(dá)最大，為22.91g/L。之后，隨發(fā)酵時間持續(xù)延長，有機(jī)酸濃度轉(zhuǎn)而下降，至第22d時，總酸濃度降低到2.10g/L。結(jié)合圖1和圖2中可溶性蛋白質(zhì)及碳水化合物濃度隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律，可知，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和碳水化合物濃度較低時，有機(jī)酸被微生物作為基質(zhì)再利用，其濃度開始迅速下降。因此，從厭氧產(chǎn)酸的角度，8d的發(fā)酵時間較為合適。

另外，除乙酸外，相對于其他有機(jī)酸，無論在什么發(fā)酵時間，厭氧產(chǎn)酸過程中均存在明顯的丙酸累積現(xiàn)象，發(fā)酵8d時丙酸累積量最高，約為5.00g/L。在厭氧產(chǎn)甲烷過程中，也常出現(xiàn)丙酸累積現(xiàn)象。有機(jī)物的厭氧消化主要是在水解發(fā)酵產(chǎn)酸菌群、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群和產(chǎn)甲烷菌群等不同微生物類群的協(xié)同作用下逐步完成的。其中，產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群將產(chǎn)酸發(fā)酵菌群代謝產(chǎn)生的丙酸、丁酸、乙醇等轉(zhuǎn)化為乙酸、氫氣和二氧化碳。然而，從生化反應(yīng)的能量學(xué)角度分析，丙酸的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸代謝是所有VFA厭氧氧化中最難發(fā)生的反應(yīng)，因在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下，丙酸被轉(zhuǎn)化為乙酸反應(yīng)的吉布斯自由能達(dá)76kJ/mol[17]，為正值，不能自發(fā)進(jìn)行，因此，丙酸常在厭氧消化系統(tǒng)中累積[18]。

圖3 發(fā)酵時間對厭氧酸化產(chǎn)物濃度及分布的影響Fig.3 Influence of fermentation time on the concentration of anaerobic acidogenic products and their distribution

2.4 發(fā)酵時間對乙酸百分比的影響

乙酸可作為微生物燃料電池的底物產(chǎn)電，乙酸還可化學(xué)合成醋酸乙烯，醋酸乙烯是合成工業(yè)塑料的單體，也可化學(xué)合成醋酸纖維素，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乳膠涂料、色素等，是重要的化工原料。因此，通常希望厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸以乙酸為主。乙酸百分比隨發(fā)酵時間的變化情況見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對乙酸百分含量的影響Fig.4 Influence of fermentation time on the percentage of acetic acid

由圖4可見，在整個發(fā)酵過程中，乙酸都是主要發(fā)酵末端產(chǎn)物，占總末端發(fā)酵產(chǎn)物比例較高，在60%～80%左右，總體隨發(fā)酵時間的增加而增加，后趨于穩(wěn)定，發(fā)酵8d時，乙酸占總有機(jī)酸的比例達(dá)到最大，為79.49%。因此，發(fā)酵時間8d最優(yōu)。

3 結(jié)論

（1）醬渣預(yù)處理液中可溶性蛋白質(zhì)和碳水化合物濃度隨發(fā)酵時間延長，先快速降低后逐步趨緩，發(fā)酵8d后基本穩(wěn)定。發(fā)酵初期，可溶性蛋白質(zhì)和碳水化合物等主要產(chǎn)酸有機(jī)底物迅速降解轉(zhuǎn)化，發(fā)酵2d時其降解率分別為62.52%和68.33%，第8d時則分別為68.60%和81.21%。相對而言，可溶性碳水化合物是較好的發(fā)酵產(chǎn)酸底物。

（2）隨發(fā)酵時間延長，發(fā)酵產(chǎn)生的總有機(jī)酸和乙酸濃度先增加后降低，并在第8d時取得最大值，分別為28.82g/L和22.91g/L，在可溶性底物被逐步消耗時，所產(chǎn)有機(jī)酸被微生物作為底物吸收再利用。乙酸是主要產(chǎn)物，占總酸比例為79.49%。厭氧產(chǎn)酸過程中存在一定量的丙酸累積現(xiàn)象，發(fā)酵8d時丙酸累積量最高，約為5.00g/L。

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