劉德海，解復紅，賈 彬，權(quán)淑靜，馬 煥，劉金剛

（1.河南省科學院 生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450008；3.河南農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，河南 鄭州 450002）

β-葡萄糖苷酶亦稱纖維二糖酶，能夠水解β-D-葡萄糖苷鍵。β-葡萄糖苷酶在食品工業(yè)很多方面得到應用，可作為特殊的風味酶應用于改良果汁風味[1]、果酒增香[2]、茶葉增香等方面[3]，能起到較好的增香效果。β-葡萄糖苷酶還可應用于生產(chǎn)大豆異黃酮活性苷元[4]，其能使大豆異黃酮苷等生物苷類物質(zhì)脫去糖基，變成分子量較小的高生物活性苷元，進而提高生物利用率。據(jù)報道，豆奶中添加β-葡萄糖苷酶或接種產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物，都能夠?qū)⒍鼓碳岸鼓谭壑猩镉行暂^低的異黃酮糖苷化合物高效轉(zhuǎn)化為高活性的異黃酮苷[5]。此外，利用β-葡萄糖苷酶法生產(chǎn)的龍膽低聚糖可預防食品中的淀粉老化和保持食品中的水分，具有增味作用和顯著的保健功能，這種酶法生產(chǎn)龍膽低聚糖具有反應條件溫和、菌種安全、污染性小、成本低廉、易于分離等優(yōu)點，是生產(chǎn)龍膽低聚糖的主要研究方向[6]。

β-葡萄糖苷酶廣泛存在于自然界各種微生物中，在一些動植物體內(nèi)也有分布，在微生物來源方面，主要研究集中在酵母、細菌、霉菌等，而其中對曲霉和康氏木霉研究較多[7]。黑曲霉不產(chǎn)生毒素，是公認的安全微生物[8]，且產(chǎn)胞外β-葡萄糖苷酶。本研究從釀造公司釀造磚曲中分離、篩選得到一株能高效生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株，經(jīng)菌株形態(tài)觀察和分子生物學鑒定將該菌株初步鑒定為黑曲霉菌（Aspergillus niger）。1材料與方法

1.1 材料與試劑

釀造磚曲，河南省伏陳醋業(yè)有限公司提供。

TaqDNA聚合酶、dNTP購于寶生物工程大連有限公司；Marker、DL2000購于上海萊楓生物科技有限公司；Tris平衡酚購于北京索寶萊科技有限公司；水楊苷購于北京博奧拓科技有限公司；纖維二糖購于美國Amresco公司；羧甲基纖維素鈉購于美國Sigma公司產(chǎn)品；3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）購于軍事醫(yī)學科學院藥材供應站；鏈霉素購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QYC-2102C全溫培養(yǎng)搖床：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；PHSJ-3F酸度計：瑞士Mettler Toledo公司；DRP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；T6新世紀紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；TGL-16B離心機：上海安亭科學儀器廠；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；SW-CT-ICU超凈工作臺：上海博訊實業(yè)有限公司；UPWS超純水器：杭州永潔達凈化科技有限公司；YP2102電子天平：上海光正醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 菌株保藏培養(yǎng)基

Czapek’s瓊脂培養(yǎng)基：NaNO33.0g，KCl0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O0.5g，蔗糖30.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，pH6.0～6.5。

1.3.2 菌株活化培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：取洗凈去皮、挖去芽眼的馬鈴薯200g，切成片狀或絲狀，加水1000mL，煮沸15min，用紗布過濾，加20g瓊脂、20g葡萄糖，再加熱使其溶化，補水至體積為1000mL。

1.3.3 富集培養(yǎng)基

酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，蒸餾水1000mL，pH7.0，加入適量鏈霉素（含鏈霉素30U/mL）。

1.3.4 纖維二糖固體平板分離培養(yǎng)基[9]

（NH4）2SO44.0g ，NaCl 2.0g，CaCO34.0g，KH2PO41.0g，纖維二糖5.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，加入適量鏈霉素。

1.3.5 纖維素-剛果紅平板分離固體培養(yǎng)基

CMC-Na 2.0g，（NH4）2SO42.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，pH值7.0，鏈霉素適量。

1.3.6 液體搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基

麩皮3g，NH4NO30.5g，KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O0.04g，CaCl20.05g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5g，蒸餾水100mL。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種分離純化方法

多點取樣四分法處理后，無菌操作條件下稱取釀造磚曲樣品適量，使之懸浮在無菌水中，振蕩10min～15min，然后加入盛有富集培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、180r/min搖床培養(yǎng)3d左右。培養(yǎng)好的富集培養(yǎng)液1.0mL分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，分別吸取10-4、10-5和10-6稀釋度的稀釋液0.1mL，于菌株活化培養(yǎng)基平板上，立即用無菌玻璃刮板進行平板涂布，然后倒置在恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，于28℃～30℃培養(yǎng)3d～5d左右，挑取長勢較好的真菌菌落采用平板劃線分離法重復以上操作，直至平板上出現(xiàn)單菌落，轉(zhuǎn)接入菌株固體斜面保藏培養(yǎng)基培養(yǎng)3d，4℃保藏備用。

1.4.2 菌株的篩選[9]

選取上述分離純化后所得的菌株，用無菌水洗下斜面真菌菌落孢子，適當稀釋后混合置于纖維二糖固體分離培養(yǎng)基平板上，于28℃～30℃培養(yǎng)，待長出菌落后，再轉(zhuǎn)接于纖維素-剛果紅平板分離固體培養(yǎng)基平板上，于28℃～30℃培養(yǎng)3d～5d左右，觀察有無透明圈及透明圈大小，挑取能夠在纖維二糖固體分離培養(yǎng)基平板上生長，且在纖維素-剛果紅平板分離固體培養(yǎng)基平板上有明顯透明圈的菌種，轉(zhuǎn)接入液體搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行產(chǎn)酶實驗復篩，培養(yǎng)條件為30℃，180r/min的搖床培養(yǎng)3d后，進行β-葡萄糖苷酶酶活力檢測分析。

1.4.3 形態(tài)學觀察[10]

將所分離菌株在PDA培養(yǎng)基上適當稀釋后培養(yǎng)，獲得單菌落，觀察其菌落形態(tài)；并利用顯微鏡觀察菌絲的特征。

1.4.4 分子生物學鑒定

（1）真菌總DNA的提取[11]

真菌總DNA的提取采用溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法，具體步驟如下：①用無菌解剖刀從培養(yǎng)皿中刮取菌絲0.1g～0.2g至1.5mL離心管中；②加入等體積的滅菌石英砂和200μL、65℃浴熱后的2%CTAB抽提液（CTAB 4g，無水乙醇5mL，蒸餾水100mL，加熱溶解，依次加入56mL的5mol/L NaCl、20mL的1mol/L pH 8.0的Tris-HCl、8mL的0.5mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），用蒸餾水定容至200mL搖勻，經(jīng)高壓滅菌，冷卻后加入2mL的1%2-巰基乙醇，4℃保存），用無菌研磨棒研磨至勻漿；③加入400μL、65℃預熱的CTAB抽提液，顛倒混勻后于65℃水浴0.5h～1.0h；④冷卻至室溫后，12000r/min離心10min，取上清液至另一離心管中；⑤加入1/2體積的Tris飽和酚（pH 8.0）及1/2體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），顛倒混勻后靜置至其開始分層；⑥12000r/min離心10min，取其上清液至另一離心管中；⑦重復5～6步2～3次，視兩相界面處雜質(zhì)的多少而定；⑧加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），輕輕顛倒混勻；12000r/min離心10min，取上清液至另一離心管中；⑨向上清液中加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻后于-4℃或-20℃沉淀1h；12000r/min離心10min，棄上清液，加入500μL、70%vol乙醇懸浮沉淀；⑩12000r/min離心5min，棄上清液，室溫干燥；加50μL無菌水或TE（10mmol/L Tris-HCl 1mmol/L EDTA）緩沖液溶解沉淀，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

（2）18S rDNA基因的PCR擴增

在50μL PCR反應體系中依次加入以下試劑：雙蒸水（dd H2O）37.0μL；10×擴增緩沖液5.0μL；d NTP 2μL；上游引物2μL；下游引物2μL；TaqDNA聚合酶0.6μL；提取的真菌模板基因組DNA 2μL，反應總體積為50μL。

擴增18S rDNA基因的引物片段為北京六合華大基因公司提供的通用真菌引物，上游引物ITS1：5’-TCCGTAGG TGAA CCTG CGG-3’和下游引物ITS4：5’-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3’。

PCR擴增條件：94℃預變性4min，94℃預變性30s，56℃預退火30s，72℃預延伸60s，30個循環(huán)，72℃預延伸10min。

PCR擴增產(chǎn)物電泳分析：PCR反應結(jié)束后，取6μL擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所用電壓170V，電泳時間30min，加溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色15min后，用清水洗脫，然后置于BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)下觀察其電泳條帶。

（3）測序及序列分析

18S rDNA基因的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)檢測出現(xiàn)明顯電泳條帶后，送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，將測序結(jié)果基因序列提交到GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中與已有的相關(guān)同源序列BALST比對分析，Clustal W程序進行多序列比對后，利用MEGA 3.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.5β-葡萄糖苷酶活力的測定方法[12]

β-葡萄糖苷酶活力的測定采用DNS法：取一支25mL的比色管，加入1.0mL 1%的水楊酸溶液（pH值為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制），于50℃水浴中熱2min～3min，加入適當稀釋酶液（發(fā)酵酶液12000r/min離心10min，取上清液）1.0mL，50℃保溫30min，反應結(jié)束后立即取出加入3.0mL 3，5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴煮沸5min顯色冷卻后定容至25mL，于波長530nm處測定OD值。另取一支比色管加入1%水楊酸溶液1.0mL，先加入3，5-二硝基水楊酸溶液3.0mL，再加滅活酶液1.0mL，作為空白對照，操作同上。

酶活力定義：在上述反應條件下，以1min內(nèi)催化底物水解生成1μg還原糖（葡萄糖）所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離篩選結(jié)果

對不同的真菌菌株進行分離純化，共得到33支菌株斜面。經(jīng)纖維二糖固體分離培養(yǎng)基平板與纖維素-剛果紅平板分離固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)初篩，得到9株既能在纖維二糖固體分離培養(yǎng)基平板上生長且在纖維素-剛果紅平板分離固體培養(yǎng)基平板上有明顯透明圈的菌株。再經(jīng)液體搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基進行產(chǎn)酶實驗，獲得3株有較好β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)能力的菌株，然后經(jīng)發(fā)酵和多次傳代，發(fā)現(xiàn)R16菌株穩(wěn)定性較好，其遺傳穩(wěn)定性見圖1，確定該菌株進行實驗。R16菌株在纖維素-剛果紅平板上產(chǎn)生的水解圈見圖2。

圖1 菌株R16遺傳穩(wěn)定性Fig.1 Genetic stability of strain R16

圖2 R16菌株在纖維素-剛果紅平板上的水解圈Fig.2 Hydrolysis circle of R16 on CMC plate

2.2 菌株R16的形態(tài)特征

菌株R16在Czapek’s瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后，直徑達1.5cm～3.0cm，其形態(tài)特征見圖3。在菌落中心初為白色菌絲絨毛狀凸起，隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸成淺黃色，最后變成褐黑色，產(chǎn)生大量褐黑色孢子，呈厚絨狀，色澤均一，無雜色，菌落不透明，無光澤，無滲出物，邊緣不整齊可見少量白色絲狀菌絲，背面與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，無色，不分泌色素，有放射狀飾紋。

圖3 R16菌株的菌落形態(tài)Fig.3 Colonial morphology of strain R16

菌株R16在高倍鏡下的形態(tài)見圖4。菌絲透明，有分支和橫隔，有足細胞，分生孢子呈球形或接近球形，呈褐色，分生孢子頭的頂囊呈球形或接近球形，分生孢子著生于分生孢子梗頂囊表面。從菌落、菌絲及孢子形態(tài)觀察可以看出，根據(jù)魏景超[10]《真菌鑒定手冊》及相關(guān)文獻有關(guān)報道，初步將菌株R16鑒定為黑曲霉菌（Aspergillus niger）。

2.3 菌株R16的分子生物學鑒定

2.3.1 菌株R16的18S rDNA基因的獲得

圖5 R16菌株18S rDNA的PCR電泳結(jié)果Fig.5 Electtrophresis PCR amplification ITS sequence from strain R16

用ITS1、ITS4真菌通用引物，以提取的該菌基因組為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測的條帶在500bp～700bp，結(jié)果見圖5。

2.3.2 菌株R16的18S rDNA的序列分析

測序后，對得到的序列圖譜進行分析，從圖譜中可以看出測序結(jié)果沒有雜峰和套峰，說明測序結(jié)果真實可靠，去除載體引物序列拼接處理后，得到完整的18S rDNA的基因序列，其測序序列片段長度為572bp，具體序列見表1。

表1 R16菌株18S rDNA序列Table 1 18S rDNA gene sequence of strain R16

2.3.3 R16菌株18S rDNA基因系統(tǒng)進化樹

圖6 菌株R16的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain R16

將測序結(jié)果基因序列提交到GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中與已有的相關(guān)同源序列BALST比對分析，結(jié)果表明，R16菌株18S rDNA基因序列與GenBank中已有的黑曲霉菌（Aspergillus niger）相似性都在99%，親緣關(guān)系最近，并在18S rDNA基因序列同源性基礎(chǔ)上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖6。結(jié)合R16菌株形態(tài)特征觀察，表明該菌株為黑曲霉屬（Aspergillus）黑曲霉菌（Aspergillus niger）。

3 結(jié)論

釀造用曲中含有多種有益微生物，方春玉等[13]從瀘型大曲分離出黑曲霉菌進行了酸性蛋白酶產(chǎn)酶研究，秦臻等[14]從保寧麩醋醋曲中定向篩選出生淀粉分解酶梨頭霉進行了產(chǎn)酶研究，李江華等[15]從酒曲中分離篩選出一株真菌α-淀粉酶產(chǎn)生菌米曲霉進行了研究。

利用纖維二糖固體平板分離培養(yǎng)基、纖維素-剛果紅平板分離固體培養(yǎng)基初篩，液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基搖瓶復篩相結(jié)合，從釀造磚曲中分離篩選出一株能高效生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株R16。通過菌株菌落的形態(tài)特征、顯微形態(tài)，及菌株18S rDNA的序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分子生物學分析，鑒定為黑曲霉屬（Aspergillus）黑曲霉菌（Aspergillus niger）。該菌株遺傳穩(wěn)定性好，其產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶安全性好，具有較高的研究應用價值。

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