包二平，黃迅悟，李洪敏，馮會(huì)成，董志明

髖膝關(guān)節(jié)結(jié)核在全身骨結(jié)核中約占30%，僅次于脊柱結(jié)核而居第二位[1]。晚期髖膝關(guān)節(jié)結(jié)核導(dǎo)致嚴(yán)重關(guān)節(jié)缺損，通常采用一期或二期人工關(guān)節(jié)置換重建關(guān)節(jié)功能，但術(shù)后結(jié)核復(fù)發(fā)問(wèn)題尚未解決。結(jié)核復(fù)發(fā)受多種因素影響，包括患者的免疫功能、抗結(jié)核化療、感染結(jié)核菌是否耐藥、人工假體選擇等。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)核分枝桿菌與兩種不同人工材料表面的黏附情況，為臨床選擇人工關(guān)節(jié)假體提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 結(jié)核分枝桿菌 結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv，北京結(jié)核病防治所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 BACTEC MGIT 960(M960)液體培養(yǎng)基，北京解放軍309醫(yī)院結(jié)核臨床實(shí)驗(yàn)室提供，將40個(gè)培養(yǎng)基進(jìn)行編號(hào)。

1.1.3 人工關(guān)節(jié)介面材料 將鈷鉻鉬合金(Chromium-Cobalt-Alloy，北京航空航天設(shè)計(jì)院提供)，制成直徑5 mm、厚1.6 mm圓柱體，按照人工關(guān)節(jié)表面處理工藝，圓柱形實(shí)驗(yàn)材料表面分別做成多孔涂層和羥基磷灰石涂層。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與結(jié)核分枝桿菌共同培養(yǎng) 將表面多孔涂層和羥基磷灰石涂層兩組表面性狀不同的實(shí)驗(yàn)材料每組各取20片，用蒸餾水超聲波震蕩洗滌后，高溫消毒。在無(wú)菌條件下用4號(hào)線固定并且懸吊于M960培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)基放一個(gè)樣本。同時(shí)將MTB用生理鹽水稀釋濃度約為1×1011CFU/L(CFU：集落形成單位)的細(xì)菌懸液。每個(gè)M960培養(yǎng)基分別加結(jié)核菌液0.5 ml，完畢后放置M960培養(yǎng)儀中，37℃下震蕩培養(yǎng)。

1.2.2 結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)情況測(cè)定 將結(jié)核分枝桿菌與實(shí)驗(yàn)材料共同培養(yǎng)28 d，每7天從培養(yǎng)兩種實(shí)驗(yàn)材料的M960培養(yǎng)基分別各取0.1 ml菌液。用721分光光度計(jì)(波長(zhǎng)590 nm、光鏡1.0 cm、蒸餾水調(diào)零)測(cè)定M960培養(yǎng)基中OD值[2]。

1.2.3 掃描電鏡觀察 將實(shí)驗(yàn)材料從液體培養(yǎng)基中取出，用生理鹽水10 ml沖洗3遍以除去表面未黏附的結(jié)核分枝桿菌，置入3%戊二醛中固定4 h后，梯度酒精(50%、70%、80%、90%)脫水，室溫下干燥，IB-5型重離子濺射儀表面噴金，PHILIP ESEM 30掃描電鏡下觀察結(jié)核分枝桿菌在材料表面的黏附情況。每塊材料隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野結(jié)核分枝桿菌總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)情況

不同時(shí)間點(diǎn)，結(jié)核分枝桿菌在兩種材料表面的OD值均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)核分枝桿菌在兩種材料表面培養(yǎng)不同時(shí)間后的OD值

2.2 電鏡觀察結(jié)果

培養(yǎng)第28天結(jié)核桿菌掃描電鏡所見(jiàn)(圖1)，多孔涂層組結(jié)核分枝桿菌黏附量明顯多于羥基磷灰石涂層組(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)第28天結(jié)核分枝桿菌與兩種材料的平均黏附數(shù)量(個(gè)/視野)

圖1 結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)28 d對(duì)兩種材料的黏附情況(掃描電鏡，10000×)

3 討論

生物材料植入術(shù)后感染是從細(xì)菌與生物材料黏附開(kāi)始[3]。黏附在材料表面的細(xì)菌不斷繁殖，產(chǎn)生較多的細(xì)胞外黏滯物，與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如纖維蛋白原等共同形成一層包繞材料的生物膜。生物膜為細(xì)菌黏附提供新的位點(diǎn)，加速其黏附，同時(shí)保護(hù)細(xì)菌免受藥物殺滅及機(jī)體的免疫攻擊，常規(guī)保守治療很難奏效，往往不得不取出內(nèi)植在關(guān)節(jié)中的內(nèi)固定物，導(dǎo)致手術(shù)失敗。

細(xì)菌黏附受生物材料表面理化性能的影響較大，如表面化學(xué)組成、表面自由能(包括修復(fù)材料的表面自由能、細(xì)菌的表面自由能及懸浮介質(zhì)的表面張力)、表面親水性/疏水性、表面粗糙度[4]及其布朗運(yùn)動(dòng)和范德華力等物理力作用。因此，通過(guò)改變種植體表面的物理性能，控制致病菌黏附和聚集，減少種植體周圍組織病變，從而提高種植體植入成功率[5-6]。由于人工假體表面處理技術(shù)不同、光澤度、孔隙度不同，結(jié)核分枝桿菌對(duì)不同假體介面黏附力是否存在差異尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

由于結(jié)核分枝桿菌屬于慢生長(zhǎng)菌，周期為24～36 h，比普通細(xì)菌傳代時(shí)長(zhǎng)約60倍[7]。結(jié)核分枝桿菌無(wú)菌毛、鞭毛、莢膜等黏附“配體”，活動(dòng)力差，對(duì)各種材料表面黏附力較弱。王鵬祥等報(bào)道結(jié)核分枝與表皮葡萄球菌對(duì)鈦及鈦合金材料表面的黏附力是不同的[8]。結(jié)核分枝桿菌在機(jī)體內(nèi)對(duì)生物材料的黏附是由多種蛋白質(zhì)共同協(xié)作的復(fù)雜生物過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中主要依靠特有的黏附素。國(guó)內(nèi)外對(duì)結(jié)核分枝桿菌的研究表明黏附素在結(jié)核分枝桿菌入侵、發(fā)病及播散方面有重要作用[9]，也是結(jié)核分枝桿菌與生物材料黏附的主要黏附物[10-11]。黏附素由結(jié)核分枝桿菌自身分泌[12]，由多種蛋白構(gòu)成，包括磷酸?；几事短擒?PIM)、肝素結(jié)合血凝集黏附素(HBHA)、纖維結(jié)合蛋白(FAP)、和層粘連蛋白(LN)等。

本研究將人工假體材料植入結(jié)核菌液中共同培養(yǎng)28 d，兩種材料對(duì)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)無(wú)明顯影響(P＞0.05)。結(jié)核分枝桿菌在多孔介面黏附量高于羥基磷灰石涂層介面(P＜0.05)。這種差異可能與兩種假體介面結(jié)構(gòu)、物理特性、接觸角和表面能等因素影響有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，結(jié)核分枝桿菌與人工關(guān)節(jié)假體介面有黏附力。結(jié)核分枝桿菌與多孔和羥基磷灰石涂層人工關(guān)節(jié)界面黏附有差異，關(guān)節(jié)結(jié)核患者人工關(guān)節(jié)置換，選擇羥基磷灰石涂層比多孔涂層更有優(yōu)勢(shì)。由于我們所選取材料的表面處理與臨床使用假體一致，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)核患者人工假體選擇提供一定參考。

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