賀瑩瑩，徐小琳，王思雨，王長海，代斌

（1石河子大學化學化工學院／新疆兵團化工綠色過程重點試驗室／省部共建國家重點實驗室培育基地，石河子832003；2南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，南京210095）

微藻種類多，生長速度快，周期短，不占用耕地，適應環(huán)境能力強，能夠進行光合自養(yǎng)并且合成許多結(jié)構(gòu)和生理功能獨特的生物活性物質(zhì)［1－4］，如多糖、蛋白質(zhì)、色素及不飽和脂肪酸等。微藻多糖具有較強的抗氧化、抗病毒及增強機體免疫力等活性［5－7］，已經(jīng)成為藥物研究的重點。

目前，熱水浸提工藝［8－13］被廣泛應用于多糖的提取，但此法通常提取溫度較高、提取時間較長并且提取效率低下。胡仲秋等［14］采用堿液提取枸杞多糖（LBP），在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行正交實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該工藝下LBP得率可達7．46%，比傳統(tǒng)水提工藝提高1．59%；Pengrong Wang等［15］采用堿提工藝優(yōu)化Monascus mycelium 多糖的提取，多糖得率較傳統(tǒng)水提方法提高2．10倍，并且堿提多糖清除O2－和DPPH自由基的能力與水提多糖相近。由于微藻中含有部分酸性多糖，因此本實驗擬選取堿液提取微藻多糖。多糖提取工藝多為單因素實驗和正交設計［16－19］，采用固定其他因素，改變一個因素的單因素考察法確定工藝條件，不能考察因素之間的相互作用，同時也很難考察多個響應值與因素之間的交互作用關(guān)系。為了提高多糖的提取效率，采用模型擬合過程更能系統(tǒng)地優(yōu)化提取工藝。響應面法［20－23］已被成功應用于微生物培養(yǎng)基組分、發(fā)酵條件和活性成分提取等工藝的優(yōu)化，它是通過擬合模型優(yōu)化過程設置來分析互作效應的數(shù)理統(tǒng)計方法，由此能反映出單因素和多種因素間的交互作用，因此被認為是較為準確可靠的優(yōu)化方法。

從新疆石河子市北湖分離得到的斜生柵藻（Scnedesmus obliquus）與實驗室另外3株微藻相比，其生物量和多糖含量都相對較高，且該藻株在穩(wěn)定期能大量自絮凝，使藻體與培養(yǎng)液分離，有利于藻體的后續(xù)大規(guī)模采收。因此，本文實驗選用斜生柵藻的干藻粉為原料，利用單因素實驗考察堿液濃度、提取溫度和提取時間對其多糖提取率的影響。在此基礎(chǔ)上，采用響應面分析法優(yōu)化提取參數(shù)，得到堿提斜生柵藻多糖的最佳工藝條件，為進一步研究斜生柵藻多糖的活性奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料和方法

1．1 材料

1．1．1 供試藻株及培養(yǎng)條件

斜生柵藻（Scnedesmus obliquus）分離于新疆石河子北湖，經(jīng)形態(tài)學鑒定為斜生柵藻，保藏于新疆兵團化工綠色過程重點實驗室。將斜生柵藻藻種接種于改良BG11培養(yǎng)基中，置于自制光照培養(yǎng)架上，培養(yǎng)條件為：溫度（24．0±2．0）℃，光照條件4000lx，連續(xù)光照，每天定時搖瓶3次并交換位置，確保微藻藻液均勻光照，避免長時間靜置。藻液培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，離心收獲，經(jīng)蒸餾水洗滌2次，冷凍干燥機干燥，保存于干燥器中，待用。

1．1．2 試劑及儀器

無水乙醇、濃硫酸、蒽酮和葡萄糖等其它試劑均為國產(chǎn)分析純。LXJ－IIB低速大容量多管離心機，上海圣科儀器設備有限公司；FA1104B電子天平，上海越平科學儀器有限公司；PK－8D電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司；GZX－9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；ALPHR 1－2LD 冷凍干燥儀，德國Christ公司；V－1100D型可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1．1．3 培養(yǎng)基

改 良 的 BG11 培 養(yǎng) 基：NaNO30．004g／L，K2HPO4·3H2O 0．240g／L，MgSO4·7H2O 0．212 g／L，CaCl2·H2O 0．036g／L，檸檬酸0．006g／L，檸檬酸鐵銨0．024g／L，EDTA Na20．001g／L，Na2CO30．020g／L，NaHCO31．424g／L和1mL／dL的微量元素溶液。微量元素溶液包含：H3BO32．860g／L，MnCl4·H2O 1．860g／L，ZnSO4·7H2O 0．220g／L，NaMoO4·2H2O 0．390g／L，CuSO4·5H2O 0．080 g／L和Co（NO3）2·6H2O 0．050g／L。

1．2 方法

1．2．1 標準曲線繪制

采用蒽酮－硫酸法［24］以葡萄糖為標準品制作標準曲線。準確稱取100mg 105℃恒重的葡萄糖（分析純），溶解并用蒸餾水定容至100mL，分別取出1、2、3、4、5mL加入到50mL的容量瓶中，配成濃度為20、40、60、80、100μg·mL－1的溶液。各取1 mL于20mL具塞試管中，再加入4mL的蒽酮試劑，待幾支試管均加完后，同時浸入100℃恒溫水浴箱中，準確保溫10min后取出，立即用流動水冷卻。于室溫下平衡約5min左右，以1mL的蒸餾水為空白，在波長620nm處測定吸光度。得標準曲線方程：A＝0．0069C＋0．0025，相關(guān)系數(shù)R2＝0．9991。

1．2．2 多糖的提取工藝及提取率計算

準確稱取斜生柵藻干藻粉50．0mg，加入5mL不同濃度的堿液，于超聲波清洗儀超聲混勻10min后置于電熱恒溫水槽中，在設定的溫度下反應一定的時間后離心，向上清液中加入3倍體積95%的乙醇，置于4℃冰箱中沉淀過夜后離心，將沉淀復溶于蒸餾水中，定容至100mL，取1mL利用蒽酮比色法測定其多糖含量，并計算多糖提取率。多糖提取率用式（1）計算：

其中：C表示由標準曲線計算得出的多糖的濃度，μg／mL；V表示多糖提取液定容后的總體積，mL；W表示實驗樣品的重量，mg。

1．3 實驗設計

采用Box－Benhnken中心組合實驗設計優(yōu)化斜生微藻多糖的提取工藝。令多糖提取率為響應值，采用 Design－Expert（v．7．1．6，Stat－Ease，Inc，Minneapolis，USA）軟件進行實驗設計和數(shù)據(jù)分析，并建立回歸模型。采用多項式回歸分析對實驗數(shù)據(jù)進行擬合，得到二次多項式為：

式（2）中：Y 是響應值；A0是常數(shù)；Ai，Aii和Aij分別代表一次項、二次項和交互作項的回歸系數(shù)；Xi和Xj是自變量的水平。

2 結(jié)果與討論

2．1 單因素實驗

影響微藻多糖提取率的因素較多，其中堿液濃度、提取溫度、提取時間3個因素影響較為顯著。本研究先通過單因素實驗確定實驗因素與水平，再進行響應面分析實驗設計。

2．1．1 堿液濃度對斜生柵藻多糖提取率的影響

綠藻中含有部分酸性多糖，它們隨著提取液堿性的增強，更易被溶出；另外，以非共價鍵形態(tài)結(jié)合在一起的多糖與蛋白質(zhì)等物質(zhì)在堿性條件下更易解離，因而多糖易被釋放出來。因此，本實驗采用堿液對斜生柵藻多糖進行提取。固定堿液浸提溫度為80．0℃，提取時間為2．0h，設定堿液質(zhì)量濃度分別為0、0．025、0．075、0．125、0．175、0．225mol／L，實驗結(jié)果見圖1。

圖1 堿液濃度對斜生柵藻多糖提取率的影響Fig．1Effect of alkali concentration on extraction yield of polysaccharides from Scnedesmus obliquus

由圖1可知：在一定溫度下，加入堿液可以顯著提高多糖的提取率，但當堿液質(zhì)量濃度超過0．175 mol／L后，多糖提取率增加不明顯，并且堿液濃度過高，多糖因降解而使得率下降。綜上所述，堿液質(zhì)量濃度選取在0．175mol／L較為合適。

2．1．2 提取溫度對斜生柵藻多糖提取率的影響

固定堿液濃度為0．175mol／L，提取時間為2．0 h，設定水浸提溫度分別為50．0、60．0、70．0、80．0、90．0、100℃，實驗結(jié)果見圖2。

由圖2可知：隨著溫度升高，多糖提取率增加顯著，但升高至90．0℃之后，多糖提取率有下降趨勢，其原因可能與多糖本身的穩(wěn)定性有關(guān)。在堿液提取時，較高溫度可能破壞多糖結(jié)構(gòu)，導致其提取率下降。單因素實驗結(jié)果顯示，提取溫度在80．0℃左右比較合適。

圖2 提取溫度對斜生柵藻多糖提取率的影響Fig．2Effect of extraction temperature on extraction yield of polysaccharides from Scnedesmus obliquus

2．1．3 提取時間對斜生柵藻多糖提取率的影響

提取時間是影響微藻多糖提取效率另一個較重要的因素。固定堿液質(zhì)量濃度為0．175mol／L，提取溫度為80．0℃，設定堿液浸提時間分別為0．50、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0h，實驗結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間對斜生柵藻多糖提取率的影響Fig．3Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharides from Scnedesmus obliquus

2．2 中心組合實驗（BBD）

2．2．1 Box－Benhnken的中心組合設計及結(jié)果分析

影響微藻多糖提取率的因素并不是孤立發(fā)生作用的，它們之間共同發(fā)生作用才最終影響微藻多糖的提取率，因此，下面采用Box－Benhnken中心組合設計，以堿液質(zhì)量濃度、提取溫度和提取時間為自變量，分別以X1、X2和X3表示，以斜生柵藻多糖提取率為因變量，即響應值，設計三因素三水平相應分析實驗，分別用－1、0、1表示三水平的高、中、低水平。具體編碼水平如表1所示，中心組合實驗方案及其實驗結(jié)果如表2所示。

表1 Box－Behnken響應面設計實驗因素及水平Tab．1Variables and levels in response surface design

表2 響應面實驗設計及結(jié)果Tab．2Experimental design and results of response surface methodology

通過 Design Expert 7．1．6軟件對實驗結(jié)果進行多元回歸分析，得出堿提斜生柵藻多糖提取率的二階模型，方程如下：

式（3）中各變量對響應值影響的顯著性由F檢驗來判定，p值越小，則相應變量的響應程度就越高。

由表3可知：上述模型可描述各因子與響應值之間的關(guān)系，模型p＜0．001，表明該回歸模型極其顯著；失擬項p為0．6918，不顯著；相關(guān)系數(shù)R2＝0．9890，說明該模型擬合度良好，實驗誤差較??；R2Adj為0．9749，表明上述模型可以解釋97．49%響應值的變化。綜上所述，此模型可分析和預測斜生柵藻多糖提取率。此外，各因素中一次項X1、X2、X3以及二次項X12和X22為極顯著，因此，各實驗因素對響應值的影響并非簡單的線性關(guān)系。

表3 斜生柵藻多糖提取預測回歸模型的方差分析Tab．3Analysis of variance（ANOVA）for regression equation

2．2．2 影響斜生柵藻多糖提取率的因素分析

響應面法的優(yōu)勢在于可以高效地確定自變量的最優(yōu)值，使得響應值最大化。各個因素及其交互作用對斜生柵藻多糖提取率的影響結(jié)果可通過響應面圖和等高線圖直觀的反映出來，本實驗響應面圖和等高線圖見圖4至6。

由圖4至6可知：提取堿液質(zhì)量濃度對斜生柵藻多糖得率的影響最大，隨著溫度的增加，多糖得率也隨之增加，若提取溫度超過80．0℃，多糖得率反而會降低；提取時間對多糖得率也有一定的影響，但時間的增加對多糖得率影響較小，從節(jié)省成本和能耗的角度考慮，增加提取時間并無益處。

采用Design－expert軟件對實驗結(jié)果進行分析，獲得斜生柵藻多糖提取的最佳條件為：堿液質(zhì)量濃度0．175mol／L，提取溫度為80．8℃，提取時間2．1 h，在此條件下，斜生柵藻多糖提取率理論值可達到10．91%。

圖4 堿液質(zhì)量濃度和提取溫度對斜生柵藻多糖提取率影響的響應面和等高線圖Fig．4Response surface and contour plot showing the interactive effects of alkali concentration and extraction temperature on the extraction yield of Scenedesmus obliquus polysaccharides

圖5 堿液質(zhì)量濃度和提取時間對斜生柵藻多糖提取率影響的響應面和等高線圖Fig．5Response surface and contour plot showing the interactive effects of alkali concentration and extraction time on the extraction yield of Scenedesmus obliquus polysaccharides

圖6 提取溫度和提取時間對斜生柵藻多糖提取率影響的響應面和等高線圖Fig．6Response surface and contour plot showing the interactive effects of extraction temperature and extraction time on the extraction yield of Scenedesmus obliquus polysaccharides

2．2．3 驗證實驗

1）根據(jù)擬合的最優(yōu)工藝條件，以堿液質(zhì)量濃度0．175mol／L、提取溫度80．8℃、提取時間2．1h對斜生柵藻多糖進行提取，提取率達到11．08%，與模型預測值接近，說明該模型預測性和可靠性很好。

2）與熱水浸提［8］（90．7℃5．1h）斜生柵藻多糖的提取率（1．93%）相比，堿液浸提優(yōu)化后的多糖提取率提高了4．74倍。堿提和熱水浸提斜生柵藻多糖的單位時間（h）提取率分別為5．28% 和0．37%，前者是后者的14．27倍，說明堿液浸提法同時提高了斜生柵藻多糖的提取效率。

3 結(jié)論

1）建立了響應值與各因素之間的數(shù)學模型，并根據(jù)此二次回歸模型，確定了斜生柵藻多糖的堿提最佳工藝參數(shù)為堿液質(zhì)量濃度0．175mol／L，提取溫度80．8℃，提取時間2．1h。此工藝條件下提取斜生柵藻多糖的提取率達到11．08%，與模型預測值接近，并且建立的數(shù)學模型（R2＝0．9890）能很好地反映各因素與提取率之間的關(guān)系。

2）優(yōu)化后的堿提斜生柵藻多糖提取率和提取效率較熱水浸提法分別提高了4．74和13．27倍。表明堿液有利于斜生柵藻多糖的提取，也驗證了響應面法優(yōu)化堿提斜生柵藻多糖工藝是可行的。

［1］曹鍵，漆開華，高孔榮．微藻的研究進展［J］．廣州食品工業(yè)科技，1996，12（4）：5－9．

［2］盧仡，林紅華，柯群．微藻的生物活性物質(zhì)及其功能［J］．食品工業(yè)科技，2011，32（7）：470－473．

［3］Singh S，Kate B N，Banerjee U C．Bioactive compounds from cyanobacteria and microalgae：an overview［J］．Critical reviews in biotechnology，2005，25（3）：73－95．

［4］Amaro H M，Guedes A C，Malcata F X．Antimicrobial activities of microalgae：an invited review［J］．Science against Microbial Pathogens：Communicating Current Research and Technological Advances，2011（3）：1272－1284．

［5］周杰，陳安國．海藻多糖的生物活性研究進展［J］．飼料工業(yè)，2005，26（18）：12－15．

［6］Costa M S S P，Costa L S，Cordeiro S L，et al．Evaluating the possible anticoagulant and antioxidant effects of sulfated polysaccharides from the tropical green alga Caulerpa cupressoides var．flabellata［J］．Journal of Applied Phycology，2012，24（5）：1159－1167．

［7］Lee J B，Takeshita A，Hayashi K，et al．Structures and antiviral activities of polysaccharides from Sargassum trichophyllum［J］．Carbohydrate Polymers，2011，86（2）：995－999．

［8］熊皓平，黃和，王博，等．響應面法優(yōu)化硇洲馬尾藻多糖提取工藝［J］．食品研究與開發(fā)，2011，32（5）：52－56．

［9］張秀紅，李宏全，李加高，等．響應面法優(yōu)化鈍頂螺旋藻FACHB－439多糖提取工藝［J］．生物技術(shù)，2010，20（6）：72－75．

［10］錢森和，厲榮玉，魏明，等．普通念珠藻多糖提取及其體外抑菌活性研究［J］．食品科學，2012，33（6）：96－99．

［11］Ye C L，Hu W L，Dai D H．Extraction of polysaccharides and the antioxidant activity from the seeds of Plantago asiatica L．［J］．International journal of biological macromolecules，2011，49（4）：466－470．

［12］Ye C L，Jiang C J．Optimization of extraction process of crude polysaccharides from Plantago asiatica L．by response surface methodology［J］．Carbohydrate Polymers，2011，84（1）：495－502．

［13］Sun Y，Li T，Yan J，et al．Technology optimization for polysaccharides（POP）extraction from the fruiting bodies of Pleurotus ostreatus by Box－Behnken statistical design［J］．Carbohydrate Polymers，2010，80（1）：242－247．

［14］胡仲秋，劉建黨，王保玲．枸杞多糖的堿液提取工藝研究［J］．西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2008，36（1）：173－178．

［15］Wang P，Chen D，Jiang D，et al．Alkali extraction and in vitro antioxidant activity of Monascus mycelium polysaccharides［J］．Journal of Food Science and Technology，2012，80（4）：1057－1061．

［16］任守利，劉塔斯，劉宇婧，等．天麻多糖提取工藝的研究［J］．湖南中醫(yī)藥大學學報，2010，30（1）：37－40．

［17］郭守軍，楊永利，姚慕貞，等．蜈蚣藻多糖提取工藝優(yōu)化［J］．食品科技，2010，35（6）：227－230．

［18］Tian S，Zhou X，Gong H，et al．Orthogonal test design for optimization of the extraction of polysaccharide from Paeonia sinjiangensis K．Y．Pan［J］．Pharmacognosy Magazine，2011，7（25）：4－8．

［19］Jiang B，Zhang H，Liu C，et al．Extraction of water－soluble polysaccharide and the antioxidant activity from Ginkgo biloba leaves［J］．Medicinal Chemistry Research，2010，19（3）：262－270．

［20］宋麗軍，張麗，尹琳琳，等．響應面法在超高壓鈍化哈密瓜汁中兩種酶研究上的應用［J］．石河子大學學報：自然科學版，2010，28（5）：600－605．

［21］孫佰平，任娟，趙思峰，等．響應面法優(yōu)化球孢白僵菌CXJ－1的發(fā)酵工藝條件［J］．石河子大學學報：自然科學版，2012，29（6）：689－695．

［22］肖國民，潘曉梅．響應面法優(yōu)化螺旋藻中葉綠素的超聲提取工藝［J］．化工學報，2009，60（11）：2813－2819．

［23］王仙，王祥軍，曹連莆，等．大麥籽?？傸S酮超聲輔助提取工藝的優(yōu)化［J］．石河子大學學報：自然科學版，2010，28（2）：152－157．

［24］Yemm E W，Willis A J．The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone［J］．Biochemical Journal，1954，57（3）：508－514．