完燕華，劉菊林，戰(zhàn)春燕，任芳媛

阿立哌唑(Aripiprazole，Ari)是日本大冢制藥公司(Otsuka公司)于1998年開發(fā)的第2代非典型性抗精神病藥，商品名為Abilify，是一種多巴胺自身受體激動劑和5-羥色胺系統(tǒng)穩(wěn)定劑，用于精神分裂癥的治療［1］。2002年美國食品和藥物管理局(FDA)批準該藥上市，2004年中國食品和藥品監(jiān)督管理局(SFDA)批準該藥上市。阿立哌唑具有錐體外系反應低、療效好、不良反應輕、耐受性好的優(yōu)點［2］。國外多采用液相色譜－質(zhì)譜，質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測定阿立哌唑在血漿中的濃度［3］，但其成本較高不便普及。為方便臨床對阿立哌唑血藥濃度的監(jiān)測和藥代動力學的研究需要，本試驗參考國內(nèi)外有關(guān)文獻［4-5］，建立了一種以乙醚 +二氯甲烷為提取劑測定人體血漿中阿立哌唑濃度的反相高效液相法(RP-HPLC)，并將其成功運用于臨床，以期為臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀(北京科瑞?？茖W儀器有限公司)，UV3000可變波長紫外分光檢測器(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)，7725i六通進樣器、色譜工作站(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)，離心機、超聲波發(fā)聲器、DG55高效液相色譜系統(tǒng)在線脫氣機(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)，柱溫箱(天津旗美公司科技有限公司)，旋渦混合器，微量進樣器 25 μl。

1.2 試劑與試藥 色譜用甲醇、乙腈(天津科密歐化學試劑有限公司)、分析用二氯甲烷、乙醚、凈化的超純水、市售分析純;阿立哌唑片(規(guī)格:10 mg/片，成都大西南制藥公司)、阿立哌唑?qū)φ掌?中國藥品生物制品鑒定所，批號:100776-200501，純度99．8%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱 C18(4．6 mm×250 mm，5 μm，迪馬公司)，檢測波長 257 nm，流動相為乙腈－甲醇，以冰醋酸 pH值調(diào)至 6．3，用前經(jīng)0．45 μm微孔濾膜過濾并超聲波脫氣，流速1 ml/min，柱溫 35℃，進樣量 15 μl，量程為 0．02 全方位吸光度單位(AUFS)，外標法定量，阿立哌唑保留時間為5．567 min，樣品測定不受干擾(圖1)。

圖1 阿立哌唑反相高效液相色譜圖

2.2 對照品溶液配制 精密稱取阿立哌唑?qū)φ掌?0 mg置容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為儲備液，濃度1 mg/ml，再將對照品儲備液分別加甲醇稀釋至 40、30、25、20、15、10、5、2．5 和1．25 μg/ml作為系列工作液，置4℃冰箱中保存，使用時用甲醇稀釋至所需濃度。

2.3 標準曲線制備 取空白血漿0．9 ml分別加入阿立哌唑不同濃度的對照工作液適量，使血漿中阿立哌唑濃度分別為 5、25、50、100、200、300、600、800 ng/ml，然后加 2 mol/L NaOH 100 μl堿化混勻，加乙醚和二氯甲烷共3 ml，渦旋混合4 min，然后以轉(zhuǎn)速3000 r/min離心10 min。準確吸取乙醚、二氯甲烷層移入另一離心管中，于50～60℃水浴中氮氣流下吹干，殘留物以甲醇80 μl充分復溶混勻，高速離心后取15 μl進樣分析。以峰面積X對應其濃度Y，進行線性回歸，得回歸方程為Y=268．3X+30．2(r=0．9967)。結(jié)果顯示，阿立哌唑在5～800 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低檢測濃度為5 ng/ml。

2.4 精密度和方法回收率 配制含阿立哌唑高、中、低3種不同濃度的血漿樣本各5份，按“2．3”項下方法處理，分別做日內(nèi)及日間試驗，計算日內(nèi)及日間的精密度(RSD)和方法回收率，見表1。

表1 精神分裂癥患者血漿阿立哌唑精密度和回收率試驗結(jié)果

2.5 重復性試驗 取空白血漿配制的含300 ng/ml樣品 1．0 ml，按“2．3”項下方法處理，測定阿立哌唑濃度，重復進樣5次，含量的RSD=1．96%，說明本法的重復性良好。

2.6 干擾試驗 為了確保血樣測定的可靠性，對臨床常用的抗精神病藥物分別配制成50和300 ng/ml的溶液，上述色譜條件下進樣15 μl，進行色譜分析，結(jié)果:氯氮平保留時間12．966 min，利培酮保留時間8．906 min，奮乃靜保留時間 13．546 min，對阿立哌唑均無明顯干擾。

2.7 血藥濃度檢測

2.7.1 診斷標準:本實驗室自2011年12月建立本方法以來，檢測阿立哌唑血藥濃度樣本34例，患者診斷均符合中國精神疾病分類方案和診斷標準第3版(CCMD-3)精神分裂癥診斷標準［6］。均為長期服藥者，其中男20例，平均年齡(38±15)歲;女14例，平均年齡(27±12)歲;病程(11±6)個月。血、尿常規(guī)及肝腎功能等實驗室檢查正常，無嚴重器質(zhì)性疾病。

2.7.2 服藥劑量:口服1次10～15 mg，2/d，服藥期間均未服用其他抗精神分裂癥藥物。

2.7.3 采血時間:于服藥2周后晨時采集靜脈血5．0 ml，分離血漿，按“2．3”項下方法處理樣本并進行測定。

2.7.4 血藥濃度測定結(jié)果:測得患者阿立哌唑平均血藥濃度為(371．2 ±36．6)ng/ml。

2.8 靈敏度 當信噪比≥2(S/N≥2)時，阿立哌唑的最低檢出量為5 ng/ml，可滿足監(jiān)測要求。

3 討論

本研究建立了測定阿立哌唑血藥濃度的RPHPLC法。在選擇測定波長時，因阿立哌唑結(jié)構(gòu)中含有2個苯環(huán)，具有共軛體系，故有明顯的紫外吸收。本試驗以甲醇為空白，在200～300 nm波長范圍內(nèi)對阿立哌唑?qū)φ找哼M行最大吸收波長紫外掃描，發(fā)現(xiàn)在220 nm和257 nm處均有最大吸收峰，但220 nm接近與末端吸收，噪聲較大，257 nm波長處吸收更靈敏，吸收值更大，故選擇257 nm作為測定波長，試驗結(jié)果穩(wěn)定可靠。另外，因阿立哌唑在甲醇中溶解度較小，為了增加阿立哌唑的溶解度，在配制濃度較大的儲備液時加醋酸溶液0．5 ml［7］。

在流動相選擇上，先以甲醇－水－乙腈作為流動相，通過對流動相中各成分不同配比研究發(fā)現(xiàn)，為使阿立哌唑縮短保留時間，峰形良好，達到好的分離效果，對流動相不同成分之間的配比進行了改進，將甲醇－水－乙腈系統(tǒng)改為甲醇－乙腈系統(tǒng)，并適量加入正丁胺和冰醋酸調(diào)節(jié)pH值。本研究發(fā)現(xiàn)，在流動相pH值為6．3時，阿立哌唑分離良好，兼顧保留時間、分離度及峰形，故選擇流動相中的甲醇為59．5%。

樣品制備方面，阿立哌唑在堿性條件下才能被有機溶劑萃取，所以在樣品預處理中加入強堿(0．1 mol/L的 NaOH)，以使信號穩(wěn)定，利于測定。試驗中曾單用乙醚進行萃取，發(fā)現(xiàn)萃取率較低。阿立哌唑易溶于二氯甲烷［8］，故使用乙醚+二氯甲烷(80∶20)進行混合萃取，萃取率高，重現(xiàn)性好，且復溶后所含雜質(zhì)較少，不影響測定。

RSD日間試驗發(fā)現(xiàn)各批次樣本保留時間稍有差異，但均在保留時間的±1．1%以內(nèi)，RSD均在允許范圍的±5%以內(nèi)［9］，此漂移差異可能由于流動相組分、柱溫及啟動分析時間等的輕微變化所致。

阿立哌唑口服吸收迅速，3～5 h達到最高血藥濃度(Cmax)，食物不影響阿立哌唑最高血藥濃度［10］。在2～30 mg的劑量范圍內(nèi)，阿立哌唑的血藥濃度與劑量呈線性關(guān)系［11］。本研究結(jié)果顯示，口服阿立哌唑片的藥代動力學特點符合二房室模型，被測患者阿立哌唑的平均血藥濃度為(371．2±36.6)ng/ml，與張國陽等［8］的研究結(jié)果基本一致。本研究方法樣品預處理過程較簡單，干擾少，色譜保留時間短，縮短了分析時間，節(jié)約了流動相，靈敏度高。該方法靈敏、準確、專一性強，可滿足臨床進行治療時藥物監(jiān)測和藥效學研究的要求。

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