尿液小分子物質(zhì)檢測(cè)及其應(yīng)用前景

陳逸南，于穎彥

當(dāng)前，在疾病檢查中，血尿便檢查是簡(jiǎn)便而重要的手段之一。除此之外，再視患者病情而增加必要的內(nèi)鏡、X線檢查等。但實(shí)踐中人們普遍感到，傳統(tǒng)的血尿便檢測(cè)靈敏度和特異度尚不高，難以滿足臨床需求。而內(nèi)鏡、X線等檢查又存在操作復(fù)雜、對(duì)受檢者影響較大等而難以作為人群普查手段。多年來(lái)，研究人員一直探尋一種簡(jiǎn)便易行、創(chuàng)傷性小且適合于疾病檢查的新方法。尿液是目前最方便獲得的生物樣本，其排泄物的變化不僅可以反映泌尿系統(tǒng)自身健康狀況，還可以反映全身的代謝狀況，圍繞尿液生物標(biāo)志物研究已有不少報(bào)道[1-8]。由于尿液中小分子含量極低，常規(guī)檢測(cè)方法不易檢測(cè)，故在尿液生物標(biāo)志物研究中，檢測(cè)方法的選擇與建立就顯得格外重要。

1 間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法

20世紀(jì)70年代建立的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)可以檢測(cè)體液樣本中的生物抗原。其基本原理是:將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性;將抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，同時(shí)要保留其免疫活性和酶活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，通過(guò)洗滌去除固相載體上其他物質(zhì)，結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的含量成比例。加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)含量相關(guān)，根據(jù)顏色反應(yīng)深淺進(jìn)行定性與定量分析。在酶催化反應(yīng)中可放大反應(yīng)效果，從而實(shí)現(xiàn)提高敏感度目的。ELISA具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，加之電腦化程度極高的ELISA檢測(cè)儀的應(yīng)用，該法已經(jīng)成為應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)方法之一。ELISA技術(shù)主要有直接法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法等。小分子抗原或半抗原因缺乏可做夾心法的2個(gè)以上抗原表位而不能用雙抗體夾心法測(cè)定，需要采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)。競(jìng)爭(zhēng)ELISA法又分為直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，以間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的靈敏度較高。其原理是標(biāo)本中的抗原和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體，前者結(jié)合力強(qiáng)而優(yōu)先與抗體結(jié)合反應(yīng)，剩余抗體與固相抗原反應(yīng)，故固相吸附的抗體與樣本中的抗原濃度成反比;之后在板孔中加入酶標(biāo)二抗，標(biāo)本中的抗原含量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)二抗愈少，最后的顯色也愈淺(圖1)。在固相包被抗原的板孔里分別加入待測(cè)抗原和特異性抗體，溫育反應(yīng)后通過(guò)洗板除去待測(cè)抗原、抗體復(fù)合物;而后在固相結(jié)合的抗體中加入酶標(biāo)二抗，溫育反應(yīng)后洗板去除多余二抗，再加入底物顯色，其顏色深度和待測(cè)樣品濃度呈反比。對(duì)小分子激素、化合物和藥物等的ELISA多采用此方法[9-14]。尿液中的小分子有機(jī)物抗原性弱，缺乏2個(gè)以上的抗原表位，故也應(yīng)當(dāng)選用間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)。根據(jù)以往報(bào)道，間接競(jìng)爭(zhēng)法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到納克(ng)水平，且成本較低，適合大樣本檢測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖1 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA

2 實(shí)時(shí)定量免疫聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)

免疫PCR技術(shù)是Sano等[15]建立的一種超高靈敏度的檢測(cè)方法，該方法綜合了固相免疫反應(yīng)和PCR兩者的特點(diǎn)，在保證免疫測(cè)定特異性的同時(shí)又具有極高的靈敏度。免疫PCR的基本原理和常規(guī)標(biāo)記免疫技術(shù)相似，只是標(biāo)記抗原或抗體的標(biāo)記物是DNA。若待測(cè)樣品為人類樣本，作為標(biāo)記物的DNA最好來(lái)自細(xì)菌或噬菌體。在固相免疫結(jié)合反應(yīng)步驟完成后再采用PCR對(duì)標(biāo)記的DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，最后通過(guò)檢測(cè)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原或抗體的定性或定量。該方法正在不斷改進(jìn)與完善當(dāng)中。在免疫PCR檢測(cè)中，固相包被的抗原與生物素化抗體結(jié)合后，洗去多余抗體再加入親和素后洗板;然后，加入生物素化的DNA，充分反應(yīng)后洗板;最后進(jìn)行PCR反應(yīng)，因?yàn)镻CR有很強(qiáng)的放大能力，可以定量檢測(cè)DNA的拷貝數(shù)(圖2)。該方法的敏感性和特異性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ELISA。在包被待測(cè)抗原后，加入生物素化特異性抗體，溫育后洗去多余生物素化抗體;隨后加入親和素，溫育反應(yīng)后洗去多余親和素;再加入生物素化DNA反應(yīng)，洗板去除多余生物素化DNA后，用實(shí)時(shí)定量免疫PCR擴(kuò)增生物素化DNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)小分子的定量。

圖2 免疫PCR方法

2.1 抗原、抗體反應(yīng)系統(tǒng) 免疫PCR中的免疫反應(yīng)和普通的ELISA類似，被檢測(cè)的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相載體，而固相載體在免疫反應(yīng)方面要求對(duì)抗原包被均勻，結(jié)合穩(wěn)定。PCR反應(yīng)要求固相載體導(dǎo)熱性能好，耐高溫，液面小且不易揮發(fā)。而抗體的特異性和親合力將影響免疫PCR的特異性和敏感性。一般均選用單克隆抗體，這個(gè)抗體常采用生物素標(biāo)記，通過(guò)親和素再結(jié)合DNA。Sano等最早采用的是直接利用DNA-抗體復(fù)合物和固相抗原結(jié)合法，但直接包被待檢抗原不適用于臨床標(biāo)本和難以吸附固相抗原的檢測(cè)。隨后陸續(xù)出現(xiàn)了夾心免疫定量 PCR法[16-19](圖3)。其原理和普通夾心ELISA類似，特異性抗體吸附至固相載體上，先后加入樣本、生物素化抗體、親和素、生物素化DNA，最終固定于固相載體上的生物素化DNA與目標(biāo)物質(zhì)的含量相關(guān)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以檢測(cè)樣本中的目標(biāo)抗原。

圖3 夾心免疫定量PCR

2.2 連接系統(tǒng) 連接系統(tǒng)是指連接抗原-抗體反應(yīng)系統(tǒng)與DNA分子之間的連接分子或復(fù)合物，是免疫PCR技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Sano等使用的是重組葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A，SPA)-鏈親和素嵌合蛋白。此嵌合蛋白的鏈親和素部分能識(shí)別DNA上的生物素，SPA部分可以被特異性抗體的Fc段所識(shí)別，IgG便與生物素化的DNA連接成復(fù)合物。然而，SPA不但可以結(jié)合特異抗體的IgG，還可以與樣品中吸附于固相載體的無(wú)關(guān)IgG結(jié)合，易導(dǎo)致本底高和特異性差。Ruzicka等[20]用商業(yè)化的親和素建立了一種免疫PCR。其基本方法是先將親和素和生物素化的DNA預(yù)結(jié)合成復(fù)合物，然后與結(jié)合固相的生物素化抗體反應(yīng)。由于1個(gè)親和素可以結(jié)合4個(gè)生物素分子，因此在預(yù)結(jié)合時(shí)如果生物素化的DNA分子過(guò)多，將親和素完全飽和，親和素就再無(wú)結(jié)合生物素化抗體的能力了。只有部分結(jié)合生物素化DNA的親和素才能起到連接分子的作用。因此，每次制備的連接分子結(jié)合能力均有差異，導(dǎo)致可重復(fù)性較差。Zhou等[21]將連接分子改進(jìn)成鏈親和素，生物素和鏈親和素都已商品化。

2.3 標(biāo)記分子DNA和PCR反應(yīng)系統(tǒng) 免疫PCR中的DNA是作為標(biāo)記分子，用DNA聚合酶將結(jié)合于固相載體上的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，由此定量檢測(cè)抗原。免疫PCR中的DNA分子可以是任何DNA，但要確保DNA的純度和較好的均質(zhì)性，且引物容易設(shè)計(jì)、易于擴(kuò)增和退火溫度適中。此外，要與待檢樣品中可能存在的DNA非同源性。在分析人類生物樣本時(shí)一般選用質(zhì)粒或細(xì)菌DNA。DNA的生物素化是用生物素標(biāo)記的脫氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate，dATP)或脫氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate，dUTP)通過(guò)DNA聚合酶標(biāo)記在DNA分子上。生物素化的DNA用量需預(yù)先選定，過(guò)多易出現(xiàn)非特異結(jié)合而引起本底過(guò)高，過(guò)低將導(dǎo)致敏感性低和出現(xiàn)不同濃度抗原得出同樣結(jié)果的飽和現(xiàn)象。

2.4 檢測(cè)系統(tǒng) 由于免疫PCR是檢測(cè)擴(kuò)增的DNA拷貝數(shù)，故可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的，可以借助于凝膠電泳、微孔板技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)等。電泳法雖然復(fù)雜耗時(shí)，但仍有一些報(bào)道[15，20，22-23]。微孔板技術(shù)包括PCR-ELISA[24]，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)大樣本的平行檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)在樣本PCR的過(guò)程中直接收集熒光數(shù)字信號(hào)，成本較低且減少了樣品的污染，是對(duì)PCR檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。McKie等[25]首次將熒光定量PCR技術(shù)和免疫PCR技術(shù)結(jié)合起來(lái)對(duì)腮腺炎病毒特異性抗體進(jìn)行了檢測(cè)。他們將指示分子通過(guò)化學(xué)交聯(lián)劑與抗體交聯(lián)，利用熒光定量PCR儀檢測(cè)指示分子，通過(guò)PCR測(cè)定出指示分子的量與檢測(cè)標(biāo)本中特異性抗體的水平呈正相關(guān)來(lái)推算樣品中特異性抗體的含量。

隨著靈敏度和再現(xiàn)性問(wèn)題的解決，實(shí)時(shí)熒光定量免疫PCR技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，有研究者利用該技術(shù)對(duì)血清中的病毒、細(xì)菌的抗原和抗體進(jìn)行檢測(cè)[17，26-29]，也有學(xué)者將該法應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)[30-31]，其檢測(cè)靈敏度達(dá)到皮克(pg)水平。

3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)

代謝物組學(xué)是后基因時(shí)代的一門學(xué)科，由英國(guó)倫敦大學(xué)帝國(guó)學(xué)院的Nicholson教授于1999年提出，旨在對(duì)生物系統(tǒng)的小分子混合物進(jìn)行分析，并對(duì)生物標(biāo)本代謝物含量變化進(jìn)行檢測(cè)。其中，磁共振技術(shù)和質(zhì)譜儀是用于代謝物檢測(cè)的最常用技術(shù)。以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的技術(shù)包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography tandem mass spectrometer，GC-MS/MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)。而 GC-MS技術(shù)由于其高分辨率、高靈敏度、可重復(fù)性而被廣泛應(yīng)用于代謝物組學(xué)研究中。近年來(lái)，人們逐漸把該技術(shù)引入尿液腫瘤標(biāo)志物的研究，并在胃癌[7]、結(jié)腸癌[32]、膀胱癌[33]、肺癌[34]、腎癌[35]、前列腺癌[36]等疾病研究中取得了一系列發(fā)現(xiàn)。GC-MS技術(shù)在尿液檢測(cè)中的作用已經(jīng)得到了人們的認(rèn)可。

3.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)工作原理 氣相色譜法是利用不同物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相分配系數(shù)的差別，使不同化合物從色譜柱流出的時(shí)間不同，以達(dá)到分離的目的。氣相色譜法提供保留時(shí)間和強(qiáng)度二維信息，得到的是二維譜圖。其最大特點(diǎn)在于高效的分離能力和高的靈敏度，因此是分離混合物的有效手段。

質(zhì)譜法是利用帶電粒子在磁場(chǎng)或電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)規(guī)律，按其質(zhì)荷比實(shí)現(xiàn)分離分析，測(cè)定離子質(zhì)量及其強(qiáng)度分布。主要特點(diǎn)是能給出化合物的分子量、元素組成、化學(xué)式及分子結(jié)構(gòu)信息，具有定性專屬性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)快速的優(yōu)勢(shì)。

氣相色譜法定性依據(jù)是色譜峰的保留時(shí)間，定量依據(jù)則是色譜峰高或峰面積。然而不同物質(zhì)總避免不了同一色譜柱上保留時(shí)間相同的可能性，而且保留值測(cè)定的重復(fù)性仍是氣相色譜法致力解決的一個(gè)問(wèn)題。另一方面，質(zhì)譜儀檢測(cè)法對(duì)樣品的檢測(cè)要求較高，樣品純度越高，雜質(zhì)形成的本底對(duì)質(zhì)譜圖產(chǎn)生的干擾越小，得到的質(zhì)譜圖越容易解析。兩者的優(yōu)劣正好互補(bǔ)，氣相色譜對(duì)樣品高效的分離能力正好滿足質(zhì)譜儀對(duì)樣品高純度的要求，而后者對(duì)純物質(zhì)準(zhǔn)確的定性能力也填補(bǔ)了氣相色譜無(wú)法定性的缺陷。樣品混合物經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)难苌幚砗筮M(jìn)入GCMS，在高溫下、汽化后在離子源的作用下樣品分子轉(zhuǎn)化為離子，隨后進(jìn)入色譜柱，經(jīng)過(guò)分離后各組分依次進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測(cè)(圖4)。汽化后的混合物在氣相色譜儀中分離，得到色譜圖;隨后，樣品離子進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測(cè)，得到各物質(zhì)質(zhì)譜圖。

圖4 GC-MS工作原理

這樣，混合物經(jīng)過(guò)GC-MS測(cè)定后，通過(guò)氣相色譜得到保留時(shí)間和強(qiáng)度信息，再?gòu)馁|(zhì)譜儀得到質(zhì)荷比和強(qiáng)度信息，從而實(shí)現(xiàn)三維信息的建立，保留時(shí)間和質(zhì)譜圖的雙重定性，大大提高了定性的準(zhǔn)確性，而后從質(zhì)譜峰強(qiáng)度信息得到樣品的含量信息。

3.2 GC-MS的定性與定量 GC-MS的定性主要手段是譜庫(kù)檢索。通常GC-MS的數(shù)據(jù)系統(tǒng)軟件都配有不同的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和譜庫(kù)檢索程序，較通用的是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)檢索系統(tǒng)。該質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)收集的質(zhì)譜圖用正常(70 eV)的電離方式，在一定條件下獲得純化合物的質(zhì)譜圖以及化合物相關(guān)信息，該質(zhì)譜圖又稱為“標(biāo)準(zhǔn)譜圖”。實(shí)際應(yīng)用中，數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)會(huì)將未知化合物和譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖逐一進(jìn)行比較，然后按相似系數(shù)(又稱匹配率)由高到低順序排列。比較的方法有兩種，一種為“正檢索”，即未知譜圖和參考譜圖逐個(gè)峰比較，看譜庫(kù)中是否存在與未知譜相同的參考譜圖;反之，看參考譜中的各質(zhì)量峰是否出現(xiàn)在未知譜中，稱為“逆檢索”。正檢索、逆檢索的匹配率最大值均為1 000，一般大于900則結(jié)果可靠性大，如小于600則可靠性較差(不同儀器有不同表示方法)。但實(shí)際上并不是匹配率高就能定性，因?yàn)椤皹?biāo)準(zhǔn)譜圖”是在特定條件下的純物質(zhì)質(zhì)譜圖，而每次檢測(cè)時(shí)GC-MS條件不同，所用儀器類型也不完全相同，得到的譜圖也會(huì)有所偏差。另一方面，異構(gòu)體、同系物、結(jié)構(gòu)相似化合物譜圖相近，檢索結(jié)果匹配率也相近，無(wú)法簡(jiǎn)單的按匹配率高低來(lái)確定，此時(shí)則需要依賴保留時(shí)間來(lái)輔助。

GC-MS分析中，計(jì)算機(jī)將采集的質(zhì)譜信號(hào)處理后以不同的譜圖形式再現(xiàn)，除了質(zhì)譜圖外，還有總離子流色譜圖(total ion current，TIC)、質(zhì)量色譜圖(mass chromatography，MC)等，是對(duì)幾個(gè)目標(biāo)化合物的特征離子進(jìn)行檢測(cè)，而不檢測(cè)不需要的質(zhì)量離子。由圖5可見(jiàn)，MC圖明顯簡(jiǎn)潔明了，不僅能排除基質(zhì)和雜質(zhì)峰的干擾，還極大地提高檢測(cè)靈敏度，該方法為目前GC-MS定量的首要方法。TIC圖相當(dāng)于色譜圖(圖6)，顯示的是經(jīng)色譜柱流出的所有組分的色譜峰。質(zhì)量色譜圖是由TIC圖重新建立的特定質(zhì)量離子強(qiáng)度隨掃描時(shí)間變化的離子流圖，其顯示為具有所選擇特征質(zhì)量的那些組分的色譜峰(圖5)。由于一次進(jìn)樣只能檢測(cè)選定的某幾個(gè)離子，其他離子都不檢測(cè)，因此其掃描靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全掃描;另外，其色譜圖比TIC圖簡(jiǎn)潔，消除了背景的干擾，因此GC-MS定量分析多采用質(zhì)量色譜峰面積定量。GC-MS常用的定量方法和色譜一樣，有歸一化法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法等。現(xiàn)代GC-MS的分離度和分析速度、靈敏度、專屬性和通用性，至今仍是其他聯(lián)用技術(shù)難以達(dá)到的。因此，只要待測(cè)成分適用于GC分離，GC-MS就成為聯(lián)用技術(shù)中首選的分析方法。

圖5 質(zhì)量色譜圖(MC圖)

圖6 GC-MS總離子流色譜圖(TIC圖)

4 尿液標(biāo)本的前處理

尿液中含有豐富的代謝產(chǎn)物，成分復(fù)雜，因此進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需進(jìn)行一定的前處理，以更好地適應(yīng)檢測(cè)方法學(xué)要求。對(duì)于ELISA和實(shí)時(shí)定量免疫PCR而言，由于尿液中可能存在的蛋白、有機(jī)物與抗體的非特異性結(jié)合會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾，因此對(duì)收集的尿樣，應(yīng)首先10 000 r/min×20 min離心后置于－80℃冰箱保存，必要時(shí)，可考慮再以截留相對(duì)分子質(zhì)量為10×103的超濾離心管5 000 r/min×20 min離心去除樣品中其余的干擾組分。相對(duì)而言，GC-MS的前處理要求較高，只有當(dāng)樣品能揮發(fā)且遇熱穩(wěn)定時(shí)才能直接進(jìn)行GC-MS分析。而尿液中許多代謝物具有親水性化學(xué)基團(tuán)，常規(guī)的GC-MS顯然不適于研究極性和親水性化合物。衍生化方法可以將難揮發(fā)或熱不穩(wěn)定化合物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變成易揮發(fā)和遇熱穩(wěn)定的化合物，然后再進(jìn)行GC-MS分析。目前，常用的衍生化法中有硅烷化反應(yīng)、酰化反應(yīng)、烷基化反應(yīng)、酯化反應(yīng)等。其中，硅烷化是GC-MS分析中最廣泛使用的衍生化方法，但其不足之處在于衍生化需花費(fèi)較多時(shí)間。Qiu等[37]最近建立了一種以氯甲酸乙酯(ethyl chloroformate，ECF)作為衍生試劑的衍生化方法，并在尿液、血液中取得成功。該方法能將尿液中的氨基酸、胺類、有機(jī)酸等物質(zhì)迅速酯化，操作簡(jiǎn)便，周期較短，穩(wěn)定性較高，適合尿液GC-MS樣品的衍生化要求。

5 尿液小分子物質(zhì)檢測(cè)臨床應(yīng)用前景

尿液中含有豐富的機(jī)體代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物以小分子化合物為主，尿液小分子化合物檢測(cè)與鑒定對(duì)技術(shù)的要求較高。前述幾種方法各有利弊，ELISA技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)技術(shù)之一。該方法成熟而成本低，特別是對(duì)于大樣本的檢測(cè)具有明顯優(yōu)勢(shì)。但是如果選用ELISA法，則必須考慮無(wú)關(guān)蛋白與抗體的非特異性結(jié)合，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。免疫PCR技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏性高，更適合于極微量抗原、抗體的檢測(cè)，但存在操作步驟比ELISA技術(shù)繁瑣的缺陷，而且免疫PCR技術(shù)處于起步階段尚未標(biāo)準(zhǔn)化。GC-MS是一項(xiàng)較為成熟技術(shù)，在低含量物質(zhì)檢測(cè)中靈敏度高且方法穩(wěn)定;其不足之處是設(shè)備昂貴，對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高，且操作過(guò)程煩瑣，樣本前處理復(fù)雜，總體檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)。對(duì)于臨床大樣本的檢測(cè)分析，GC-MS成本較高，作為臨床常規(guī)應(yīng)用尚有困難。尿液小分子具有采集方便、無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，尿液小分子的檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物并進(jìn)行分子診斷，實(shí)現(xiàn)分子醫(yī)學(xué)向臨床轉(zhuǎn)化[38]。綜上所述，目前GC-MS主要用于科學(xué)研究中樣品定量的金標(biāo)準(zhǔn);ELISA技術(shù)仍然是臨床最常用的檢測(cè)方法，對(duì)于大樣本的檢測(cè)篩查仍然首選ELISA法，如能進(jìn)一步提高ELISA法靈敏度和特異度，其可在在臨床中發(fā)揮更大作用;實(shí)時(shí)定量免疫PCR技術(shù)靈敏度高而具有較大的發(fā)展空間，如其儀器、試劑能進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化、商品化，其前景將更加廣闊。

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