林黛琴，萬承波，邱 萍,劉花梅

(1. 江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測院，江西 南昌 330029；2.南昌大學(xué)化學(xué)系，江西 南昌 330031)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定食品中4種黃色工業(yè)染料

林黛琴1，萬承波1，邱 萍2,劉花梅1

(1. 江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測院，江西 南昌 330029；2.南昌大學(xué)化學(xué)系，江西 南昌 330031)

為了快速、高效的檢測食品中非法添加的工業(yè)染料，為食品安全監(jiān)督檢測提供技術(shù)依據(jù)，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)定性定量分析食品中非法添加的堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O、酸性橙Ⅱ、酸性金黃4種黃色工業(yè)染料。樣品用乙腈提取、離心后上清液過0.22 μm聚四氟乙烯膜，電噴霧離子源多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測，空白基質(zhì)曲線外標(biāo)法定量，其中堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O采用正離子掃描模式(ESI+)，酸性橙Ⅱ、酸性金黃采用負(fù)離子掃描模式(ESI-)進(jìn)行檢測，以超純水(正離子掃描時(shí)水中含有0.1%甲酸)-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，洗脫液流速0.3 mL/min。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，得到了較寬的線性范圍和較低的定量檢出限：堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的線性范圍均為5.0～200.0 μg/L，酸性橙Ⅱ和酸性金黃的線性范圍均為5.0～100.0 μg/L，線性相關(guān)系數(shù)均在0.999以上；食品中堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O、酸性橙Ⅱ、酸性金黃的定量限分別為50、50、75、60 μg/kg。方法的回收率和重現(xiàn)性較好，4種染料的回收率在75.6%～119.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.1%～9.1%之間。該方法操作簡單、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于食品中4種非法添加工業(yè)染料的定量及確證分析。

堿性橙Ⅱ；堿性嫩黃O；酸性橙Ⅱ；酸性金黃；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)

堿性橙Ⅱ(basic orangeⅡ)、堿性嫩黃O(auramine O)、酸性橙Ⅱ(orange acidⅡ)、酸性金黃(metal yellow)都屬于偶氮類工業(yè)染料，分子結(jié)構(gòu)式示于圖1，主要用于腈綸、家具、紙張、紡織品、皮革及化妝品的染色。這些染料具有致癌、致畸變性[1-2]，對人體健康具有嚴(yán)重的危害，在我國這些染料被嚴(yán)禁作為食品添加劑使用[3]。衛(wèi)生部印發(fā)的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》中明確規(guī)定，食品中的堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O、酸性橙Ⅱ及酸性金黃屬于違法添加物質(zhì)。這些染料在中性或偏堿性條件下與蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的吸附作用，比食用色素更易給食品染色，染色后色澤鮮艷且不易褪色，價(jià)格又較低廉，因此常被一些不法食品加工商用來對豆制品、蜜餞、辣椒制品及黃魚等食品進(jìn)行染色，因此，針對此類工業(yè)染料建立簡便、快速、高效的檢測方法已勢在必行。

目前這4種工業(yè)染料的檢測方法多為高效液相色譜法[4-17]、液相色譜-質(zhì)譜法[18-22]、氣相色譜-質(zhì)譜法[23-24]和薄層色譜法[25]。其中液相色譜法不能對目標(biāo)化合物準(zhǔn)確定性，會(huì)產(chǎn)生一些假陽性。文獻(xiàn)報(bào)道的液相色譜-質(zhì)譜法主要是結(jié)合固相萃取小柱測定的，這不僅使樣品前處理步驟繁瑣，也加長了樣品檢驗(yàn)的周期，并增加了實(shí)驗(yàn)成本。本工作采用簡單的前處理步驟對各類具有代表性的食品進(jìn)行同時(shí)快速檢測，并確證被檢食品中是否含有堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O、酸性橙Ⅱ及酸性金黃4種工業(yè)染料。

圖1 4種染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of four dyes

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器

Agilent 6410A液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有Agilent 1200高效液相色譜儀及電噴霧離子源；Milli-Q超純水器：美國Millipore公司產(chǎn)品；IKA T25均質(zhì)器：德國IKA公司產(chǎn)品；SI Vortex Genie 2漩渦混合器：美國Scientific Industries公司產(chǎn)品；KQ-600DE型數(shù)控超聲清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Sigma 3-18K低溫離心機(jī)：德國Sigma公司產(chǎn)品；Eyela MMV-1000W振蕩器：日本Eyela公司產(chǎn)品。

1.2主要材料與試劑

堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O(純度>98%)：美國Acros organics公司產(chǎn)品；酸性橙Ⅱ、酸性金黃(純度>98%)：德國Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)：美國Honeywell有限公司產(chǎn)品；甲酸(色譜純)：美國Tedia公司產(chǎn)品；氯化鈉(分析純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水；0.1 %甲酸水溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列中堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O濃度系列為：5.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L；酸性橙Ⅱ和酸性金黃濃度系列為：5.0、20.0、50.0、100.0 μg/L。

1.3實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(3.5 μm×2.1 mm×100 mm)；進(jìn)樣量:5 μL；柱溫:40 ℃；流速:0.3 mL/min；正離子掃描模式中流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：含0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫：0～2.0 min，10%A；2.0～10.0 min，10%～100%A；10.0～13.0 min，100%A；13.0～13.1 min，100%～10%A；13.1～20.0 min，10%A。負(fù)離子掃描模式中流動(dòng)相A: 乙腈；流動(dòng)相B：超純水。梯度洗脫：0.0～5.0 min，20%～100%A；5.0～8.0 min，100%～100%A；8.0～8.1 min，100%～20%A；8.1～15.0 min，20%A。

1.3.2質(zhì)譜條件 ESI(+)離子源和ESI(-)離子源兩種掃描模式，質(zhì)譜參數(shù)一致。霧化氣壓力3.1×105Pa，毛細(xì)管電壓4 000 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流速8 L/min。4種染料的監(jiān)測離子對、保留時(shí)間、解離電壓和碰撞電壓等質(zhì)譜分析優(yōu)化參數(shù)列于表1。

表1 4種染料的質(zhì)譜分析優(yōu)化參數(shù)

1.4樣品制備

1.4.1固體樣品 稱取200 g調(diào)味品、肉制品等粉狀、糊狀固體樣品，破碎均勻，然后稱取2 g (精確至0.01g)固體樣品置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈，渦旋1 min后，振蕩5 min，超聲提取30 min，于4 ℃冷凍離心機(jī)中以15 000 r/min離心10 min；移取乙腈層至另一離心管中，殘?jiān)?0 mL乙腈再次提取，合并有機(jī)相，定容至20 mL，加2.5 mL水和約0.5 g氯化鈉，于-20 ℃冷凍2 h，取出后于0～4 ℃下以10 000 r/min離心5 min；從乙腈層取適量過0.22 μm聚四氟乙烯膜，LC-MS/MS測定。

1.4.2液體樣品 稱取5 g(精確到0.01 g)果汁或酒精飲料等樣品于50 mL塑料離心管中，加入1 g氯化鈉，20 mL乙腈，渦旋混勻15 s，震蕩20 min，離心分層，收集上層有機(jī)相于50 mL塑料離心管內(nèi)，剩余水相再加入20 mL乙腈提取1次，合并有機(jī)相，定容至50 mL，取適量過0.22 μm聚四氟乙烯膜，供LC-MS/MS測定。

1.4.3基質(zhì)空白外標(biāo)曲線的配制 分別稱取2 g(精確至0.01 g)固體空白基質(zhì)樣品和5 g(精確到0.01 g)液體空白基質(zhì)樣品，每份樣品按上述萃取過程進(jìn)行處理，得到的基質(zhì)提取液用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及高含量樣品的溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1高效液相色譜條件的優(yōu)化

分別對資生堂MGⅡ C18柱(5 μm×2.0 mm×150 mm)和ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(3.5 μm×2.1 mm×100 mm)這兩種不同高效液相色譜柱進(jìn)行選擇，其中資生堂MGⅡ C18柱對各組分分離效果較好，但色譜柱分離時(shí)間較長；ZORBAX Eclipse XDB-C18柱也能很好地分離各組分，且分離時(shí)間較短，因此本實(shí)驗(yàn)選擇ZORBAX Eclipse XDB-C18柱作為高效液相色譜柱?？疾煲宜徜@(含0.1%甲酸)-乙腈、乙酸銨-乙腈、水(含0.1%甲酸)-乙腈、水-乙腈等不同的流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)不同流動(dòng)相體系中各組分的峰面積差別不是很明顯，所以選擇了簡單的體系：水(含0.1%甲酸)-乙腈(正離子模式)和水-乙腈(負(fù)離子模式)。

2.2前處理?xiàng)l件優(yōu)化

文獻(xiàn)報(bào)道中常用于提取堿性橙和堿性玫瑰精的溶劑有乙醇溶液[4]、酸化甲醇、堿化甲醇溶液[5,21]、乙酸銨水溶液-甲醇-甲酸提取液[18,22]、70%乙醇水溶液[20]、甲醇溶液[19]等。本研究在分析腐竹、番茄醬、橄欖、香脆豆、黃魚、醬油、果粒爽和辣椒粉等8種不同類型的樣品時(shí)，分別對乙腈、70%乙醇水溶液、70%甲醇水溶液和乙醇氨溶液的提取效率進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，4種提取溶液的提取率依次為：75.6%～92.3%、50.6%～63.0%、68.6%～87.0%、65.6%～89.0%。結(jié)果表明，對于不同種類的食品，乙腈提取效率更高，考慮到實(shí)驗(yàn)所用的流動(dòng)相為乙腈，因此本方法最終選擇乙腈作為提取溶劑。對于軟飲料試樣通過鹽析作用使乙腈與水相分層；對于調(diào)味品、肉制品試樣，采用冷凍和離心處理去除油脂及天然大分子色素。

2.3質(zhì)譜定量定性

根據(jù)堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O分子結(jié)構(gòu)的特征，選用電噴霧正離子(ESI+)電離模式對標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行Q1全掃描；而酸性橙Ⅱ鈉鹽和酸性金黃選用電噴霧負(fù)離子(ESI-)電離模式對標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行Q1全掃描。分別準(zhǔn)確的找出各分子離子峰(見質(zhì)譜條件1.3.2)，繼續(xù)對其子離子進(jìn)行Q3全掃描，找出2～3個(gè)信號較強(qiáng)的碎片離子與母離子組成監(jiān)測離子對，以多反應(yīng)監(jiān)測模式對待測物進(jìn)行定性和定量檢測，4種染料的定量離子為：m/z121.1(堿性橙Ⅱ)、m/z147.0(堿性嫩黃O)、m/z171.0(酸性橙Ⅱ)、m/z156(酸性金黃)，其離子掃描圖和解離圖示于圖2。

4種染料的裂解機(jī)理推斷如下：堿性橙Ⅱ的氯化物m/z248.7脫氯斷裂后得到分子離子m/z213.1，分子離子m/z213.1脫去苯環(huán)m/z77.1[C6H5]得到m/z136.1 [M+-C6H5]，進(jìn)一步脫去其中1個(gè)氨基得到m/z121.1[M+-C6H5-NH2]；堿性嫩黃O的氯化物m/z303.8脫氯斷裂后得到分子離子m/z268.2，分子離子m/z268.3脫去芳香胺上的甲基得到m/z252.2 [M+-H-CH3]，分子離子m/z268.3脫去其中1個(gè)苯胺得到m/z147.1 [M+-C6H5NC2H6]，m/z147.1進(jìn)一步脫去酰胺得到m/z122.3 [M+-C6H4NC2H6-CN])，m/z122.3繼續(xù)脫掉1個(gè)甲基得到m/z107.4；酸性橙Ⅱ的鈉鹽m/z350.3脫鈉斷裂后得到分子離子m/z327.2，分子離子m/z327.2在MS2中進(jìn)行離子掃描，改變誘導(dǎo)碰撞能量，斷開化學(xué)鍵得到特征碎片離子m/z155.8[C6H4SO3]和m/z170.9 [C10H7ON2]；酸性金黃的鈉鹽m/z375.4脫鈉斷裂后得到分子離子m/z351.9，分子離子m/z351.9在MS2中進(jìn)行離子掃描，改變誘導(dǎo)碰撞能量，斷開化學(xué)鍵得到特征碎片離子m/z156和m/z80。

2.4工作曲線與定量檢出限

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行樣品測定時(shí)，由于樣品中待測組分痕量、樣品基質(zhì)復(fù)雜、提取凈化步驟繁瑣，通常使用同位素內(nèi)標(biāo)法校正操作過程中待測物質(zhì)的損失。本實(shí)驗(yàn)研究的4種染料無法得到同位素內(nèi)標(biāo)物，為了考察基質(zhì)離子抑制對定量結(jié)果的影響，在50.0、100.0、200.0μg/kg 3個(gè)添加水平下，分別采用空白樣品提基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線及用乙腈溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線對其進(jìn)行定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者的回收率差異較大，不同樣品的基質(zhì)效應(yīng)也不一樣，離子化效率在45%～69%之間，可見存在基質(zhì)減弱效應(yīng)，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的回收率，所以在實(shí)驗(yàn)中必須考慮扣除基質(zhì)干擾，從而提高定量的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)選擇了基質(zhì)空白加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制工作曲線，進(jìn)行外標(biāo)法定量，其中堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O的質(zhì)量濃度為：5.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L；酸性橙Ⅱ和酸性金黃的質(zhì)量濃度為：5.0、20.0、50.0、100.0 μg/L。以4種染料的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。根據(jù)基質(zhì)空白工作曲線最低濃度點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行推算，當(dāng)信噪比S/N=10時(shí)，對應(yīng)的目標(biāo)化合物含量為方法的定量檢出限；當(dāng)信噪比S/N=3時(shí)，對應(yīng)的目標(biāo)化合物含量為方法的定性檢出限。4種染料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及辣椒基質(zhì)和樣品的MRM圖示于圖3。本方法的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限列于表2。

圖2 堿性橙Ⅱ(a)、堿性嫩黃O(b)、酸性橙Ⅱ(c)及酸性金黃(d)的離子掃描圖和解離圖Fig.2 Product ion scans spectra and proposed fragmentation scheme of basic orange Ⅱ(a), auramine O(b), orange acid Ⅱ(c) and metal yellow(d)

圖3 4種染料混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(a,b)、辣椒粉基質(zhì)空白(c,d)、辣椒粉樣品在檢出限添加水平(e,f)的MRM譜圖Fig.3 Multiple reaction monitoring chromatograms of a mixed standard solution of four yellow dyes(a,b)， a blank chilipowder sample(c,d) and the blank Chilipowder sample spiked with four yellow dyes(e,f)

表2 4種黃色染料的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

2.5回收率、精密度實(shí)驗(yàn)及實(shí)際樣品檢測

通過可靠途徑，獲得沒有添加這些染料的腐竹、番茄醬、橄欖、香脆豆、黃魚、醬油、果粒爽及辣椒粉8種樣品，分別添加了3個(gè)不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平重復(fù)測定6次，以基質(zhì)空白工作曲線進(jìn)行定量，計(jì)算回收率及精密度(以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示)，結(jié)果列于表3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本方法有良好的精密度和準(zhǔn)確度，可以滿足痕量分析要求。應(yīng)用上述方法分別檢測了市場上的腐竹、番茄醬、橄欖、香脆豆、黃魚、醬油、果粒爽及辣椒粉各3份樣品，結(jié)果在某一品牌的辣椒粉中檢測出了堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O，含量分別為0.36 mg/kg和3.076 mg/kg，可見仍有不法企業(yè)無視國家有關(guān)規(guī)定，將工業(yè)染料用于食品的染色。

表3 不同食品中4種黃色染料的回收率和精密度

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)定性定量分析食品中非法添加的堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O、酸性橙Ⅱ、酸性金黃4種黃色工業(yè)染料。本方法準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，前處理方法簡單、快捷，測定結(jié)果令人滿意，可應(yīng)用于食品中堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O、酸性橙Ⅱ及酸性金黃的檢測，可為食品安全監(jiān)督檢測提供有力的技術(shù)依據(jù)。

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RapidDeterminationofFourHighYellowDyesinFoodsbyHPLC-MS/MS

LIN Dai-qin1, WAN Cheng-bo1, QIU Ping2, LIU Hua-mei1

(1.JiangxiInstituteofSupervision&InspectiononProductQuality,Nanchang330029,China;2.DepartmentofChemistry,NanchangUniversity,Nanchang330031,China)

A method based on high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was developed for rapid determination of the residues of four yellow industrial dyes(basic orangeⅡ, auramine O, orange acidⅡand metal yellow) in foods. The sample were extracted by acetonitrile, and then analyzed in multiple reaction monitoring (MRM) mode. Sample matrix-matched calibration was used to determine the residue contents by external standard. Basic orangeⅡ and auramine O were detected with positive ion model, while orange acidⅡ, metal yellow were detected with negative ion model. The mobile phase was ultrapure water (containing 0.1% formic acid for positive ion model)-acetonitrile. Under the optimized detection conditions, the linear ranges for basic orangeⅡ and auramine O are 5.0—200.0 μg/L, and for orange acidⅡand metal yellow are 5.0—100.0 μg/L, the linear correlation coefficients are all more than 0.999. The limits of quantification of basic orangeⅡ, auramine O, orange acidⅡand metal yellow are 50, 50, 75, 60 μg/kg, respectively. The recoveries of 4 dyes range from 75.6% to 119.0% with relative standard deviations (RSD) of 3.1%—9.1%.This method is simple, effective, sensitive， which is suitable for the determination and confirmation of four industrial dyes added in the foods illegally.

basic orangeⅡ; auramineO; orange acidⅡ; metal yellow; high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (HPLC-MS/MS)

O 657.63

A

1004-2997(2013)05-0170-09

10.7538/zpxb.2013.34.03.0170

2012-12-20；

2013-02-05

江西省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項(xiàng)目(GZJK201004)資助

林黛琴(1979～)，女(漢族)，江西東鄉(xiāng)人，分析化學(xué)專業(yè)。E-mail: zzl0711@126.com