傅興圣，鄒立思，劉訓(xùn)紅，居文政，馬 陽，侯 婭，李艷蓉

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046)

UPLC-ESI-TOFMS/MS分析太子參中環(huán)肽類成分

傅興圣，鄒立思，劉訓(xùn)紅，居文政，馬 陽，侯 婭，李艷蓉

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046)

建立超高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI -TOF MS/MS)分析太子參中環(huán)肽類成分的方法。實(shí)驗(yàn)采用反相C18色譜柱，梯度洗脫，分離并檢測太子參中11種環(huán)肽類成分。通過信息關(guān)聯(lián)采集(IDA)模式，運(yùn)用動(dòng)態(tài)背景扣除 (DBS)，消除背景離子干擾，在獲得11種環(huán)肽類成分MS/MS圖譜的同時(shí)，也得到其精確的分子質(zhì)量信息。

超高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜；太子參；環(huán)肽類

太子參是臨床常用補(bǔ)益中藥，為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.)PaxexPaxetHoffm.的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤肺之功效[1]。太子參含環(huán)肽類、苷類、糖類、揮發(fā)性物質(zhì)、脂肪酸及酯類等化學(xué)成分，具保護(hù)心肌、促進(jìn)免疫、抗氧化、抗應(yīng)激、治療糖尿病及止咳等藥理作用[2-11]。目前已從太子參中分離得到16種太子參環(huán)肽類成分，其廣泛的生理活性是醫(yī)藥領(lǐng)域研究的新熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ESI -TOF MS/MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)太子參中環(huán)肽類成分進(jìn)行精確質(zhì)量數(shù)分析和鑒定，為探索太子參藥材的功效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量變化規(guī)律及質(zhì)量調(diào)控機(jī)制提供技術(shù)支撐和參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

超高效液相色譜儀：日本Shimadzu公司產(chǎn)品；Triple TOF TM 5600 System-MS電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品。

太子參環(huán)肽(Heterophyllin)A、B對(duì)照品：由云南昆明植物研究所譚寧華研究員提供；乙腈(色譜純)：德國Merck公司產(chǎn)品；甲醇(色譜純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；太子參對(duì)照藥材(批號(hào)：121004-200604)：由中國藥品生物制品檢定研究院提供；水為自制超純水；其他試劑為分析純。

1.2供試品溶液的制備

取1.0 g太子參對(duì)照藥材，加入50 mL甲醇，超聲處理(功率250 W，頻率30 kHz)45 min，冷卻，過濾。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

1.3實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：ODS C18(100×2.1 mm×1.8 μm)；流動(dòng)相A：V(ACN)∶V(H2O)(含2 mmol NH4Ac及0.1%FA)=5∶95；流動(dòng)相B：V(ACN)∶V(H2O)(含2 mmol NH4Ac及0.1%FA)=95∶5；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫條件：0～10 min、85%～50%A，10～20 min、50%～40%A，20～25 min、40%～85%A；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長203 nm。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)正離子模式，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000，噴霧電壓4.5 kV，氣簾氣(curtain gas)20 L/min，霧化氣(Gas1)70 L/min，輔助氣(Gas2)80 L/min，離子源溫度400 ℃，碰撞電壓30 V，碰撞室射出電壓(CXP)9 V，碰撞氣(CAD)6.9×104Pa，去簇電壓(DP)100 V,射入電壓10 V。

2 結(jié)果與討論

2.1太子參中環(huán)肽類成分的UPLC-ESI-TOFMS/MS分析

根據(jù)設(shè)定的儀器條件，取供試品溶液進(jìn)樣分析。太子參甲醇提取液總離子流圖示于圖1。

圖1 太子參甲醇提取液UPLC-ESI-TOF MS/MS總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of the methanol extract of Pseudostellariae Radix by UPLC-ESI-TOF MS/MS

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的太子參環(huán)肽類成分，在總離子流圖基礎(chǔ)上對(duì)各環(huán)肽類成分提取離子流圖，得到11種環(huán)肽的提取離子流圖，示于圖2。環(huán)肽對(duì)照品的串聯(lián)質(zhì)譜圖示于圖3。太子參中環(huán)肽類成分總離子流圖的保留時(shí)間(tR)、質(zhì)荷比(m/z)理論值和測定值列于表1，各成分的測定值和理論值相差較小。

太子參環(huán)肽在正離子模式下，靈敏度較高，主要出現(xiàn)[M+H]+峰，而其他碎片峰較小。圖2中的峰1在MS中給出了m/z502.266 1 [M+H]+，在MS/MS中給出了m/z261.124 3、318.145 8、389.183 3，根據(jù)文獻(xiàn)[8]推斷其為太子參環(huán)肽Pseudostellarin A。

圖2 11種環(huán)肽類成分的UPLC-ESI-TOF MS/MS提取離子流圖Fig.2 Extract ion current chromatogram of 11 cyclic peptides in Pseudostellariae Radix by UPLC-ESI-TOF MS/MS

圖3 太子參環(huán)肽對(duì)照品的串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectra of cyclic peptides references in Pseudostellariae Radix

表1 太子參中11種環(huán)肽類成分的UPLC-ESI-TOF MS/MS分析

峰2在MS中給出了m/z785.419 1 [M+H]+，在MS/MS中給出了m/z308.197 6、395.228 9、452.251 8、509.273 0、672.335 6，根據(jù)文獻(xiàn)[10]推斷其為太子參環(huán)肽Pseudostellarin F。

峰3在MS中給出了m/z683.351 3 [M+H]+，在MS/MS中給出了m/z302.151 2、399.204 6、513.248 0、570.269 7，根據(jù)文獻(xiàn)[9]推斷其為太子參環(huán)肽Pseudostellarin B。

峰4在MS中給出了m/z779.444 7 [M+H]+，在MS/MS中給出了m/z377.250 3、569.301 2，與文獻(xiàn)[3]報(bào)道及Heterophyllin B對(duì)照品保留時(shí)間和質(zhì)譜信息一致，確認(rèn)其為太子參環(huán)肽Heterophyllin B。

峰5在MS中給出了m/z714.418 4 [M+H]+，在MS/MS中給出了m/z211.145 1、324.229 8、601.337 4，根據(jù)文獻(xiàn)[10]推斷其為太子參環(huán)肽Pseudostellarin D。

峰6在MS中給出了m/z813.451 0 [M+H]+，在MS/MS中給出了m/z358.213 9、471.298 9、629.368 3，根據(jù)文獻(xiàn)[9]推斷其為太子參環(huán)肽Pseudostellarin C。

峰7在MS中給出了m/z728.434 1 [M+H]+，在MS/MS中給出了m/z197.128 3、310.213 3、457.282 0、514.303 2、627.388 0，與文獻(xiàn)[3]報(bào)道及Heterophyllin A對(duì)照品保留時(shí)間和質(zhì)譜信息一致，確認(rèn)其為太子參環(huán)肽Heterophyllin A。

峰8在MS中給出了m/z817.423 9 [M+H]+，在MS/MS中給出了m/z245.128 4、332.160 8、536.250 0、746、3 781，根據(jù)文獻(xiàn)[11]推斷其為太子參環(huán)肽Pseudostellarin G。

峰9在MS中給出了m/z861.450 5 [M+H]+，在MS/MS中給出了m/z294.182 7、663.352 2，根據(jù)文獻(xiàn)[6]推斷其為太子參環(huán)肽Pseudostellarin H。

峰10在MS中給出了m/z878.513 1 [M+H]+，在MS/MS中給出了m/z252.135 0、365.219 0、618.361 7、765.430 6，根據(jù)文獻(xiàn)[10]推斷其為太子參環(huán)肽Pseudostellarin E。

峰11在MS中給出了m/z665.366 03 [M+H]+，在MS/MS中給出了m/z330.182 6、387.204 1、534.272 1、647.358 1，根據(jù)文獻(xiàn)[12]推斷其為太子參環(huán)肽Heterophyllin D。

2.2討論

目前，太子參品質(zhì)評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分主要有皂苷、多糖、氨基酸、環(huán)肽等[13-20]，尤其是環(huán)肽類成分已作為太子參藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的法定指標(biāo)[1]，但不同產(chǎn)區(qū)太子參中環(huán)肽含量差異顯著，且與太子參傳統(tǒng)藥效的相關(guān)性尚不清楚。關(guān)于太子參中環(huán)肽類成分分析已有報(bào)道[18-19]，但只是用高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜分析太子參中環(huán)肽類化合物，對(duì)環(huán)肽類進(jìn)行初步鑒定，難以確定其肽鍵的斷裂順序。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，通過信息關(guān)聯(lián)采集模式，并運(yùn)用動(dòng)態(tài)背景扣除，消除背景離子干擾，對(duì)太子參中環(huán)肽類成分進(jìn)行分析鑒定，提取離子流信號(hào)強(qiáng)度可進(jìn)行環(huán)肽類成分的相對(duì)含量及定量分析；一級(jí)質(zhì)譜給出了11種環(huán)肽類成分的精確質(zhì)荷比，二級(jí)質(zhì)譜給出了11種環(huán)肽類成分碎片離子的精確質(zhì)荷比。

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AnalysisofCyclicPeptidesinPseudostellariaeRadixbyUPLC-ESI-TOFMS/MS

FU Xing-sheng，ZOU Li-si，LIU Xun-hong，JU Wen-zheng，MA Yang，HOU Ya，LI Yan-rong

(NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210046，China)

The cyclic peptides inPseudostellariaeRadixwere analyzed by ultra performance liquid chromatography-electro spray ionization time-of-flight-tandem mass spectrometry (UPLC-TOF MS/MS). Eleven cyclic peptides inPseudostellariaeRadixwere separated by a reversed-phase C18 column using gradient elute conditions. With the help of information dependent acquisition (IDA) mode and dynamic background subtraction (DBS), the interference of background ion was eliminated, and the MS/MS spectraogram of 11 cyclic peptides and accurate molecular mass were acquired.

UPLC-ESI-TOF MS/MS；PseudostellariaeRadix； cyclic peptides

O 657.63

A

1004-2997(2013)03-0179-06

10.7538/zpxb.2013.34.03.0179

2012-10-24；

2013-02-26

國家自然科學(xué)基金(No.81274016)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(ysxk-2010)資助

傅興圣 (1986～),男(漢族), 碩士研究生, 從事中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。E-mail：hlhfxs@163.com

劉訓(xùn)紅 (1959～), 男(漢族),教授,從事中藥鑒定與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。E-mail：liuxunh1959@sohu.com