厚樸酚兩種提純工藝的比較研究

袁 琳，孫東坡，程 寒，戴 康*

1中南民族大學(xué)藥學(xué)院;2中南民族大學(xué)科研處武漢 430074

厚樸(Cortex Magnoliae officinalis)是我國傳統(tǒng)、珍貴中藥材，據(jù)《中國藥典》2010年版一部收載，其來源為木蘭科植物厚樸(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)或凹葉厚樸(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)的干燥干皮、根皮和枝皮。目前，在全國制藥行業(yè)中利用厚樸配方的中成藥多達200余種。厚樸的活性成分包括木脂素類(厚樸酚、和厚樸酚、三羥基厚樸酚、去三羥基厚樸酚、四氫厚樸酚、異厚樸酚)，揮發(fā)油(桉葉醇、聚傘花素、石竹烯、反丁香烯、芹子烯、杜仲烯、十六酸)，生物堿(木蘭箭毒堿、氧化黃心樹寧堿)和少量皂苷，鞣質(zhì)等［1，2］。其中厚樸酚與和厚樸酚是厚樸的兩種主要活性成分，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗?jié)兒兔黠@的中樞性肌肉松弛作用等多種生物學(xué)活性［2，3］，在臨床上具有重要的作用及應(yīng)用。厚樸的提取方法較多，但原有的提取方法［4-7］多用到堿進行分離和純化，而含酚羥基的化合物在堿性條件下易氧化，導(dǎo)致提取產(chǎn)率下降以及增加提取困難。本研究比較了堿提酸沉法與乙醇浸提石油醚萃取法對厚樸酚進行分離純化，后者盡可能的減少厚樸酚在堿性環(huán)境下的暴露以提高提取效率，且工藝流程簡單，耗時短，所用試劑常規(guī)并可回收重復(fù)使用，整個提取過程不需要昂貴儀器。為工業(yè)大量生產(chǎn)提供一定的依據(jù)，也為開發(fā)厚樸有效成分新藥提供原材料。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UItimata3000高效液相色譜(戴安中國有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA(上海亞榮生化儀器廠);ZF-6型三用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司);AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵(上海東璽制冷儀器設(shè)備有限公司);DZ-IBC真空干燥箱(天津市金泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

厚樸(購于廣西省玉林市第三中藥材市場，經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院萬定榮教授鑒定為木蘭科植物厚樸的干燥干皮、根皮及枝皮);GF254薄層硅膠板10×20 cm(青島海浪硅膠干燥劑廠);厚樸酚對照品(湖北省藥檢所)。乙醇、石油醚、乙酸乙酯、環(huán)己烷、二氯甲烷(以上試劑均為分析純);重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 厚樸酚的提取

2.1.1 堿提酸沉法

稱取100 g厚樸，粉碎后加入600 mL 4%氨水，加熱回流提取3次，每次4 h，并且每隔1 h從冷凝管頂端向燒瓶中加入氨水11 mL以保證溶液堿度在pH 11左右，提取液成棕黑色，合并三次的提取液，冷卻后減壓抽濾，濾液用鹽酸調(diào)至pH 3，置4℃冰箱中靜置，析出絮狀沉淀，過濾，濾餅連帶濾紙置于50℃烘箱中烘干，得7.05 g粗提物。將其剪碎，以環(huán)己烷280 mL加熱回流3 h，過濾，取濾液在40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，得到淡黃色晶體0.092 g。

將所得粗晶進行薄層色譜檢測，以氯仿-乙酸乙酯(9∶1)、苯-甲醇(27∶1)、石油醚-乙酸乙酯(7∶3)三種體系展開后在254 nm下監(jiān)視及以1%硫酸香草醛顯色后薄層板上都有兩個斑點。因此法所獲厚樸酚量過少且不純，故未進行下一步的檢測。

2.1.2 乙醇浸提石油醚萃取法

稱取400 g厚樸，粉碎后以四倍體積乙醇浸泡24 h，室溫下重復(fù)浸泡三次，將浸泡液過濾合并，于50℃在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮成小體積。然后用石油醚多次萃取，至石油醚層呈微黃色或接近無色，合并石油醚層液體并在40℃減壓濃縮，靜止冷卻至室溫，析出大量的方形晶體，表面吸附有少量的褐色油狀物，析晶母液為黃綠色透明液。析晶移出在濾紙上吸除部分油狀物，母液繼續(xù)濃縮，靜置，析出晶體，合并兩次結(jié)晶。用二氯甲烷-石油醚(4∶1)進行多次重結(jié)晶得1.540 g晶體A。

重結(jié)晶:將晶體A置于100 mL燒杯中，先取12 mL二氯甲烷將晶體完全溶解，再加入3 mL石油醚，溶液稍出現(xiàn)混濁，靜置，使溶劑自然揮發(fā)，待溶劑快揮發(fā)完畢時，即有多量晶體析出，移出上清夜，下層晶體繼續(xù)用二氯甲烷溶解來多次重結(jié)晶，至晶體呈純白色粉末。薄層色譜檢測以氯仿-乙酸乙酯(9∶1)、苯-甲醇(27∶1)、石油醚-乙酸乙酯(7∶3)三種體系展開后在254 nm下監(jiān)視及以1%硫酸香草醛顯色后薄層板上都僅有一個斑點為止，得化合物A晶體1.058 g。

2.2 定性檢測

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品9 mg，用甲醇溶解，配成0.9 mg/mL的對照品儲備溶液。精密量取2 mL儲備溶液，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制成0.18 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱定取待測晶體10 mg，置具塞錐形瓶中，加入甲醇10 mL，搖勻，再精密量取2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 TLC檢測

將待檢溶液和對照品液點在薄層板上，用氯仿-乙酸乙酯(9∶1)、苯-甲醇(27∶1)、石油醚-乙酸乙酯(7∶3)展開后在254 nm波長下檢測，及以1%硫酸香草醛顯色后，薄層板上都僅有一個斑點，且與對照品在同一高度。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 A無色結(jié)晶;mp.100～102°C;UV(EtOH)λmax220，293 nm;1H NMR(DMSO，400 MHz)δ:9.013(2H，s，2-OH)，6.944(4H，d，H-4，H-6，H-4'，H-6')，6.809(2H，d，H-3，H-3')，5.936(2H，m，H-8，H-8')，5.043(4H，dd，H-9，H-9')，3.277(4H，d，H-7，H-7')。以上數(shù)據(jù)與文獻［8］對照，確定化合物A為厚樸酚(magnolol)，其結(jié)構(gòu)為:

圖1 化合物A(厚樸酚)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of compound A(magnolol)

2.4 HPLC檢測

2.4.1 色譜條件

色譜柱為Waters C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相為甲醇∶水(78∶22);流動相流速為1.0 mL/min;檢測波長254 nm;進樣量20 μL;柱溫30℃。

2.4.2 對照品溶液的制備

參照2.2.1。

2.4.3 供試品溶液的制備

參照2.2.2。

圖2 厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品(A)與實驗中純化出的化合物A(B)的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of magnolol standard(A)and purified compound A(B)

從厚樸中提取、分離和精制出的厚樸酚經(jīng)HPLC檢測，其保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間一致，初步判斷為厚樸酚，其純度達99%以上。

3 討論

目前厚樸酚與和厚樸酚的研究已經(jīng)比較充分，提取分離方法比較多，如堿提酸沉法、超聲法、柱分離法、高速逆流色譜法、超臨界流體萃取法等。本研究采用了乙醇浸提石油醚萃取法與常用的堿提酸沉法進行比較，結(jié)果表明乙醇浸提石油醚萃取法分離厚樸酚，具有簡單易行、安全、耗時短、試劑毒性小且耗量少(可以回收重復(fù)利用)、不需要大型昂貴精密儀器設(shè)備等優(yōu)點，后續(xù)處理實驗容易，且所獲產(chǎn)物純度高(可達99%)，利于生產(chǎn)多量高純度的厚樸酚。

在厚樸的提取過程中，最易干擾其純度的是它的同分異構(gòu)體和厚樸酚。在本提取工藝中，兩步內(nèi)就能夠提取出厚樸酚，而沒有受到和厚樸酚的干擾，分析原因可能是因為厚樸酚的極性較和厚樸酚小而其含量較和厚樸酚大，使其更易溶于非極性溶劑石油醚且含量較多，在此極性段內(nèi)的雜質(zhì)較少，厚樸酚的純度較高，溶液飽和而析出厚樸酚晶體。此外，本工藝過程操作簡便，步驟縮短減少了厚樸酚在空氣中的暴露時間避免酚羥基的氧化，有利于厚樸酚活性的保持及減少其它成分的干擾。總之，乙醇浸提石油醚萃取法提取工藝設(shè)計簡單可行，可望適用于工業(yè)大生產(chǎn)。

1 Cui CX(崔乘幸)，Xu GR(許光日)，Tang B(湯波).The separation and structure determination of components from EtOAc extract of magnolia officinalis.J Henan Inst Sci Tech，Nat Sci(河南科技學(xué)院學(xué)報，自科版)，2008，36:40-42.

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