南極磷蝦中蝦青素超臨界CO2 萃取方法研究

翁 婷，金銀哲，陶寧萍 ，王錫昌

上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306

磷蝦是一類多年生的海洋浮游甲殼動(dòng)物，屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、磷蝦目，體形似小蝦，長(zhǎng)4～5 cm，最大的可達(dá)7 cm。目前共發(fā)現(xiàn)的磷蝦共有85種，生活在南極水域的11 種磷蝦統(tǒng)稱為南極磷蝦，其中數(shù)量最多、個(gè)體最大的是南極大磷蝦，也就是我們平常所稱的南極磷蝦(Euphausia superba)［1］。據(jù)最新預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)，南極約有6.5～10 億噸的磷蝦資源，幾乎整個(gè)南極海域都有分布。開(kāi)發(fā)和利用南極磷蝦資源不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且具有重要的社會(huì)意義。俄羅斯和日本等國(guó)將南極磷蝦加工成傳統(tǒng)的海產(chǎn)品，已經(jīng)上市很多年。歐美等西方國(guó)家也相繼成功開(kāi)發(fā)南極磷蝦油，該制品被認(rèn)為可預(yù)防心腦血管疾病、炎癥、惡性腫瘤、癡呆癥、糖尿病、視力減退等多種疾病。這些功能被推測(cè)是由多種不飽和脂肪酸和其它脂溶性物質(zhì)(類胡蘿卜素、維生素、甾醇等)相互疊加效應(yīng)造成的。類胡蘿卜素主要存在于南極磷蝦的甲殼中，含量約為3～4 mg/100 g 冰鮮樣，其中含有豐富的蝦青素［2］。因此，南極磷蝦是提取蝦青素的良好原料。

類胡蘿卜素(Carotenoids)，分子式一般為C40H56，是一類呈黃色、橙紅色或紅色的多烯類物質(zhì)。它是國(guó)際公認(rèn)的具有生理活性的功能性色素，是人體及動(dòng)物維生素A 的重要來(lái)源;同時(shí)也是一類非常有效的抗氧化劑，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蝦青素(Astaxanthin)是類胡蘿卜素的含氧衍生物，屬于酮式類胡蘿卜素，全稱為3，3'-二羥基-4，4'-二酮基-β，β'-胡蘿卜素。蝦青素中4 個(gè)異戊二烯以共軛雙鍵結(jié)構(gòu)存在，其自由基淬滅活力是β-胡蘿卜素的10倍、維生素E 的100 倍，同時(shí)具有抵御紫外線、抗腫瘤、提高免疫力、增強(qiáng)神經(jīng)連通和改善生育等作用，在食品添加劑、水產(chǎn)養(yǎng)殖、化妝品及保健品等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

類胡蘿卜素的提取方法有很多種，一般采用溶劑法來(lái)提取甲殼類動(dòng)物的類胡蘿卜素［3］。選用提取劑在考慮提取效果的同時(shí)，也要考慮溶劑的毒性。氯仿等試劑，提取效果明顯，但毒性較大，易揮發(fā)，并存在致癌風(fēng)險(xiǎn)。工業(yè)上，常用正己烷等溶劑提取類胡蘿卜素，這些溶劑提取效果差，成本高，提取過(guò)程中易造成活性成分的氧化降解。超臨界CO2萃取技術(shù)(Supercritical CO2extraction，SC-CO2extraction)是近年來(lái)發(fā)展的一種新型的分離技術(shù)，因具有低溫、操作簡(jiǎn)單、效率高、無(wú)污染、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，被稱為天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)中的一種具有相當(dāng)發(fā)展?jié)摿Φ母咝绿崛》蛛x方法，可適用于蝦青素的提取。

分光光度法(Spectrophotometry)和高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)是常用的兩種類胡蘿卜素分析方法，這兩種方法各有特點(diǎn)，分別適用于不同的分析測(cè)定要求。HPLC 法測(cè)定因其分析精確度高，重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)可用于蝦青素的定量測(cè)定。分光光度法雖然不能分離測(cè)定單種類胡蘿卜素的量，但作為總類胡蘿卜素測(cè)量的常用方法，具有快速、簡(jiǎn)單、易操作、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)。

目前，超臨界CO2流體萃取蝦青素的研究集中于藻類和甲殼類廢棄物，主要影響因素有:樣品原料特性、萃取壓力、溫度、時(shí)間、CO2用量和流速、夾帶劑的選擇和用量。國(guó)內(nèi)外以超臨界CO2流體萃取南極磷蝦中蝦青素的研究報(bào)道較少。Abdelkader［4］等以超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦青素，比較超臨界CO2法和有機(jī)溶劑法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，超臨界CO2法萃取效果明顯優(yōu)于有機(jī)溶劑法。該研究?jī)H討論了萃取溫度，壓力對(duì)蝦青素萃取率的影響。Reverchon E［5］等人的研究結(jié)果顯示，超臨界CO2流體為非極性溶劑，在提取過(guò)程中，添加適量的極性?shī)A帶劑，可以有效地提高蝦青素的溶解力和選擇性。一般常用的夾帶劑有乙醇，二氯甲烷等，從食品安全的角度考慮，乙醇因其無(wú)毒的特點(diǎn)而成為人們使用最多的夾帶劑。本研究選用凍干的南極磷蝦作為研究對(duì)象，采用超臨界CO2萃取法萃取南極磷蝦中的蝦青素，并結(jié)合高效液相色譜法，分析討論夾帶劑(無(wú)水乙醇)用量，萃取壓力和溫度對(duì)萃取率的影響，從而確定最佳工藝參數(shù)，為工業(yè)大規(guī)模提取南極磷蝦蝦青素提供基礎(chǔ)理論依據(jù)，促進(jìn)加工企業(yè)的發(fā)展和漁業(yè)資源的可持續(xù)利用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

南極磷蝦由我國(guó)“南極海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用項(xiàng)目組”于南極FAO 48.1 區(qū)捕撈，船上凍結(jié)后-20℃左右凍藏，冷凍方式運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。每塊完整的南極磷蝦約20 kg(規(guī)格為23 ×14 ×6 cm)經(jīng)塑料密封包裝，并貯藏于-30 ℃冰柜直至使用。經(jīng)測(cè)定，該批次南極磷蝦中水分含量為78.26 ±0.03%，粗脂肪含量為3.87 ±0.05%，灰分含量為3.08 ±0.03%，粗蛋白含量為13.68 ±0.04%。對(duì)其進(jìn)行冷凍干燥后，經(jīng)測(cè)定水分含量為2.19～3.81 g/100 g，迅速碾磨粉碎，顆粒大小約為0.180～0.250 mm，分別裝入自封袋中，避光、密封于-80 ℃以下待用。

CO2、N2純度大于99.99%，購(gòu)自上海利旦氣體有限公司;蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，CA10307000，純度為＞95. 5%，購(gòu)自Dr. Ehrenstorfer GmbH，德國(guó);甲醇(MeOH)、二氯甲烷(DCM)、乙腈(ACN)、水為色譜純，其余試劑為分析純，GF254硅膠薄層板，購(gòu)自國(guó)藥試劑有限公司。

1.2 主要儀器、設(shè)備

Spe-ed SFE-2 超臨界萃取儀，美國(guó)Applied Separations 公司;Waters e2695 高效液相色譜儀，配有2998 紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters 公司;XbridgeTMC18色譜柱(4. 6 × 250 mm，5 μm)，美國(guó)Waters 公司;Avanti J-26 XP 真空冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter 公司;UV-2000 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司;A11 組織勻漿機(jī)，德國(guó)IKA公司;BT224S 分析天平;層析缸，10 ×20 cm，上海生工生物工程公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 類胡蘿卜素的提取和測(cè)定

總類胡蘿卜素的提取和測(cè)定參照Chalida Niamnuy 等的方法［6］，在其基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。稱取3.5 g左右凍干的南極磷蝦樣品，置于50 mL 離心管，加入20 mL 丙酮，均質(zhì)2 min，4 ℃、5000 g 離心10 min，收集上清液，重復(fù)4 次萃取，直至上清液基本無(wú)色，合并丙酮萃取液于分液漏斗中。向分液漏斗中加入等量的石油醚(80 mL)，充分搖動(dòng)，再加入100 mL 的氯化鈉溶液(0.1%，w/v)，靜置分層，棄去下相，無(wú)水Na2SO4干燥、過(guò)濾，濾液40 ℃以下減壓濃縮至干，即得南極磷蝦類胡蘿卜素提取物。將提取物溶解于25 mL 的正己烷中，以相應(yīng)的有機(jī)溶劑作對(duì)照，置于1 cm 加蓋石英吸收池內(nèi)，掃描樣品的吸收光譜，掃描范圍為350～600 nm，蝦青素標(biāo)樣作對(duì)照品，分光光度計(jì)法測(cè)定提取物中類胡蘿卜素的含量。

1.3.2 類胡蘿卜素的分離

類胡蘿卜素的鑒定方法參照文獻(xiàn)中的方法［7］。薄層層析展開(kāi)劑體積比為丙酮:正己烷=1∶3，層析板為硅膠G 薄層板，使用前110 ℃下活化30 min。取一定量樣品、蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品多次點(diǎn)樣于硅膠板上，待點(diǎn)樣點(diǎn)風(fēng)干后，放入已盛有展開(kāi)劑的層析缸進(jìn)行展開(kāi)，待展開(kāi)劑到達(dá)距硅膠板上層邊緣2 cm 左右時(shí)取出。

1.3.3 超臨界CO2流體萃取南極磷蝦蝦青素

稱取12 g 左右樣品均勻填置于50 mL 萃取釜內(nèi)，加入夾帶劑無(wú)水乙醇，設(shè)定萃取溫度、分離溫度，檢查設(shè)備的氣密性。打開(kāi)CO2、N2貯氣罐閥門，從鋼瓶中流出的CO2經(jīng)凈化進(jìn)入冷凝箱液化冷凝至流體，與N2一起經(jīng)高壓計(jì)量泵加壓至所需的萃取壓力，然后經(jīng)加熱器加熱至設(shè)定溫度，由底部進(jìn)入萃取釜內(nèi)進(jìn)行萃取，靜態(tài)萃取30 min 后，打開(kāi)分離閥動(dòng)態(tài)萃取3 h，收集萃取物待用?？疾煲韵? 個(gè)因素對(duì)蝦青素的提取效果:夾帶劑用量(0.30、0.50、0.67、0.83、1.00 mL/g 干樣)、萃取溫度(45、50、55、60、65℃)、萃取壓力(20、25、30、35、40 MPa)。

1.3.4 HPLC 測(cè)定蝦青素含量

色譜柱為XbridgeTMC18柱(4. 6 × 250 mm，5 μm);流動(dòng)相為MeOH-DCM-ACN-H2O(85∶5∶5∶5，v/v);流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為20 μL;紫外檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng)480 nm;采用色譜峰保留時(shí)間定性，外標(biāo)法峰高定量。準(zhǔn)確稱取蝦青素對(duì)照品10 mg，用混合溶劑(MeOH-DCM，2∶1，v/v)溶解定容至25 mL 棕色容量瓶中作為蝦青素的對(duì)照品儲(chǔ)備液，實(shí)驗(yàn)所用低濃度的對(duì)照品溶液由混合溶劑稀釋而得，溶液保存于4 ℃冰箱。將減壓濃縮的類胡蘿卜素提取物和不同條件下的超臨界萃取物，用混合溶劑定容至一定體積，混勻得樣品溶液，微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾后測(cè)定蝦青素的含量，計(jì)算蝦青素得率(%)=超臨界萃取物中蝦青素含量/原料中蝦青素含量×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

分析測(cè)定均做三次平行，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 13.0 處理，描述性統(tǒng)計(jì)值使用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 類胡蘿卜素的吸收光譜

以正己烷為溶劑，配置一定濃度的蝦青素溶液，用分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行波長(zhǎng)掃描(350～600 nm)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示，蝦青素溶液和南極磷蝦類胡蘿卜素樣品的吸收光譜基本相同，在470～475 nm的范圍內(nèi)，蝦青素和南極磷蝦類胡蘿卜素樣品的吸光值之間的差別不大，這與相關(guān)研究中報(bào)道的蝦青素是南極磷蝦主要類胡蘿卜素的結(jié)果相符合［2］。因此可選擇該范圍內(nèi)的472 nm 作為測(cè)量波長(zhǎng)。

圖1 類胡蘿卜素提取物和蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜Fig.1UV absorption spectra of carotenoids extract and astaxanthin standard

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取1.0 mg 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，用二氯甲烷溶解后移入25 mL 棕色容量瓶中，稀釋至刻度，混勻，配成40 μg/mL 的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取配制好的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于25 mL 容量瓶中，加正己烷定容至刻度混勻，相當(dāng)于0.16、0.32、0.48、0.64、0.80、0.96 μg/mL 作為標(biāo)準(zhǔn)系列對(duì)照液。以正己烷為空白調(diào)零，可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定472 nm 處的吸光值為縱坐標(biāo)，蝦青素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸線性方程可表示為Y=0.63X-0.0178，相關(guān)線性系數(shù)為R2=0.9991，結(jié)果表明蝦青素在0.16～0.96 μg/mL 范圍內(nèi)，吸光度與蝦青素濃度呈良好的線性關(guān)系。經(jīng)檢測(cè)，南極磷蝦中含類胡蘿卜素的含量為4.80 ±0.08 mg/100 g 干樣。

2.3 薄層層析分離類胡蘿卜素

本實(shí)驗(yàn)中，從右至左依次將蝦青素標(biāo)樣、南極磷蝦類胡蘿卜素的提取物(平行樣1、2、3)展開(kāi)于薄層上，所得圖譜如圖2，測(cè)量各Rf值。由圖2 可知，類胡蘿卜素的提取物均展開(kāi)6 個(gè)點(diǎn):A(Rf=0.235，橙色)、B(Rf=0.364，橙色)、C(Rf=0.411，橙色)、D(Rf=0.652，黃色)、E(Rf=0.727，橙色)、F(Rf=0.838，橙色);而在與之對(duì)應(yīng)的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的水平位子上有一對(duì)應(yīng)的橙色斑點(diǎn)，其Rf值為0.232，因此可初步判斷樣品中存在蝦青素。為了進(jìn)一步確證南極磷蝦中含有蝦青素。

圖2 類胡蘿卜素提取物和蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的TLC 圖譜Fig.2 TLC chromatograms of carotenoids extract and astaxanthin standard

本文采用HPLC 來(lái)進(jìn)一步鑒定。蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品和南極磷蝦類胡蘿卜素供試液按HPLC 色譜條件進(jìn)實(shí)驗(yàn)。色譜圖如3 所示:南極磷蝦類胡蘿卜素供試液中相應(yīng)峰(T=4.30)與蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間(T=4.31)極為接近，經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器210～800 nm 紫外掃描表明，二者紫外吸收?qǐng)D譜極為相似，均在480 nm 處有最大吸收，結(jié)合TLC 圖譜分析，判斷南極磷蝦類胡蘿卜素供試液保留時(shí)間為4.30 min峰為蝦青素。經(jīng)檢測(cè)，南極磷蝦中蝦青素的含量為0.80 ±0.04 mg/100 g 干樣。

圖3 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和類胡蘿卜素提取物(B)的HPLC 色譜圖Fig.3 Chromatograms of standard astaxanthin (A)and carotenoids extract (B)

2.4 超臨界CO2 萃取南極磷蝦蝦青素研究

2.4.1 超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦油

前期的實(shí)驗(yàn)［8］中，以超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦干中的蝦油(圖4)，考察了萃取壓力，溫度和時(shí)間對(duì)于萃取率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萃取壓力，溫度和時(shí)間對(duì)蝦油萃取效果影響為:壓力＞溫度＞時(shí)間。隨著壓力的增加，超臨界CO2流體的密度增加，使得流體的溶解能力增加，同時(shí)分子間傳質(zhì)的距離減少，蝦油與CO2流體之間的傳質(zhì)效率增加，有利于蝦油的萃取。

圖4 萃取壓力、溫度和時(shí)間對(duì)南極磷蝦蝦油提取率的影響Fig.4 Effects of extraction pressure，temperature and time on the extraction yield of Antarctic krill oil

蝦青素是南極磷蝦中一種弱極性的脂溶性色素。超臨界CO2萃取蝦青素過(guò)程中添加適量的夾帶劑可有效提高蝦青素在CO2流體中的溶解力和選擇性。Krichnavaruk 等人［9］對(duì)比討論了夾帶劑添加前后對(duì)蝦青素的提取效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示夾帶劑添加后，蝦青素的提取效果明顯提高。本實(shí)驗(yàn)采用超臨界CO2萃取法提取南極磷蝦蝦青素，以無(wú)水乙醇為夾帶劑，考察了夾帶劑用量，萃取溫度和壓力對(duì)于南極磷蝦中蝦青素提取的影響。

2.4.2 夾帶劑用量對(duì)南極磷蝦蝦青素得率的影響

固定萃取溫度45 ℃、萃取壓力25 MPa、靜態(tài)浸提30 min、動(dòng)態(tài)萃取180 min，考察夾帶劑用量(0.30～1.00 mL/g 樣品)對(duì)南極磷蝦蝦青素得率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。在萃取壓力、溫度、時(shí)間不變的條件下，隨著夾帶劑用量的增加，南極磷蝦蝦青素的得率快速增加，伴隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，增加幅度減小，萃取趨于飽和。這可能是由于夾帶劑的添加，改變了CO2的密度，顯著地改變超臨界CO2流體的極性，同時(shí)與蝦青素形成氫鍵或其他特定的化學(xué)作用力，大大增加被分離組分在超臨界CO2中的溶解度［10］。隨著夾帶劑用量的增加，樣品萃取近乎飽和，相應(yīng)溶解度增加效應(yīng)變緩，所以選擇1.00 mL/g 作為超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦青素的最佳夾帶劑用量。

2.4.3 萃取溫度對(duì)南極磷蝦蝦青素得率的影響

固定萃取壓力25 MPa、靜態(tài)浸提30 min、動(dòng)態(tài)萃取180 min、夾帶劑用量1.00 mL/g 樣品，考察萃取溫度(40～65 ℃)對(duì)南極磷蝦蝦青素得率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。在萃取壓力，時(shí)間和夾帶劑用量不變得條件下，南極磷蝦蝦青素的得率隨著萃取溫度的升高而增加，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大值81. 34 ±1.37%，超過(guò)60 ℃時(shí)，蝦青素的得率略有下降。超臨界CO2萃取過(guò)程中，升高溫度增加了物質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)而有利于萃取，同時(shí)降低了超臨界流體的密度，使物質(zhì)的溶解度降低而不利于萃取。因此，得率的高低取決于溫度改變后，超臨界流體密度和物質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)二者之間的相互作用［10］。低于60 ℃時(shí)，得率隨著溫度升高而增大，這由于物質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)增加占主導(dǎo)地位;高于60 ℃時(shí)，得率隨著溫度的升高而減小，這由于超臨界流體密度降低占主導(dǎo)地位。此外，蝦青素是熱敏性物質(zhì)，萃取溫度過(guò)高容易導(dǎo)致降解，活性失活。所以選擇60 ℃作為超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦青素的最適宜萃取溫度。

2.4.4 萃取壓力對(duì)南極磷蝦蝦青素得率的影響

固定夾帶劑用量1.00 mL/g 樣品、萃取溫度60℃、靜態(tài)浸提30 min、動(dòng)態(tài)萃取180 min，考察壓力從20～40 MPa 變化對(duì)南極磷蝦蝦青素得率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。在20～40 MPa 之間，南極磷蝦蝦青素的得率隨壓力的升高而增加，在35 MPa 時(shí)達(dá)到最大值84.41 ±0.57%。這主要是因?yàn)殡S著壓力的增加，超臨界CO2流體的密度增加，使得流體的溶解能力增加，同時(shí)分子間傳質(zhì)的距離減少，蝦青素與CO2流體之間的傳質(zhì)效率增加，有利于蝦青素的萃取。超過(guò)35 MPa 后，顆粒之間堆積密度過(guò)大，減少了蝦青素與CO2流體的接觸面積及萃取通道［10］，達(dá)不到最佳的萃取效果，因此得率略有下降。此外，壓力的增加導(dǎo)致儀器的要求提高，實(shí)驗(yàn)成本的增加，同時(shí)也增加了不安全因素。所以選擇35 MPa 為超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦青素的最適宜萃取壓力。

圖5 夾帶劑用量(A)、萃取壓力(B)和溫度(C)對(duì)南極磷蝦蝦青素得率的影響Fig.5 Effects of the concentration of entrainer (A)，pressure (B)and temperature(C)on the astaxanthin extraction yield of Antarctic krill

2.5 多元逐步回歸模型的建立

SPSS 13.0 軟件中多元逐步回歸模型建立可用于揭示被解釋變量與其他多個(gè)解釋變量間的線性關(guān)系。逐步回歸分析時(shí)，軟件對(duì)自變量逐步引進(jìn)并檢驗(yàn)、剔除不顯著變量，直到?jīng)]有顯著的變量引入回歸方程為止。本研究中，3 個(gè)變量夾帶劑用量，萃取溫度和萃取壓力分別以A、B、C 表示，利用SPSS 13.0軟件建立逐步回歸模型，綜合考慮夾帶劑用量，萃取溫度和萃取壓力對(duì)南極磷蝦蝦青素得率的影響。

表1 是當(dāng)各步引入影響最大的變量后對(duì)其各自的偏回歸系數(shù)的方差分析。在模型1，變量夾帶劑用量(A)引入方程，其偏回歸系數(shù)的F =30.026，P(sig.)≈0. 000 ＜0. 01。在模型2，變量萃取壓力(C)引入方程，其偏回歸系數(shù)的F=30.422，P(sig.)≈0.000 ＜0.01，可見(jiàn)變量夾帶劑用量(A)，萃取壓力(C)依次被引入回歸方程時(shí)對(duì)回歸方程的影響均極顯著，變量萃取溫度(B)的偏回歸系數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即對(duì)回歸方程影響不大，故未被引入回歸方程。

表2 是當(dāng)各步引入對(duì)回歸方程影響最大的變量時(shí)有關(guān)的偏回歸系數(shù)及t 檢驗(yàn)。引入變量夾帶劑用量(A)，得第一回歸方程Y =26.388 +49.73A。第二次引入變量萃取壓力(C)，得第二回歸方程Y =4.896 +44.984A +0.952C。變量夾帶劑用量(A)、萃取壓力(C)所對(duì)應(yīng)的P 值分別為0，0.013 均小于0.05，說(shuō)明它們的回歸檢驗(yàn)均有顯著性。綜上所述，逐步回歸方程Y =4.896 +44.984A +0.952C 可用于綜合解釋夾帶劑用量，萃取溫度和萃取壓力對(duì)南極磷蝦蝦青素得率的影響，其中夾帶劑用量和萃取溫度對(duì)蝦青素的提取有著顯著性的影響。

表1 多元逐步回歸模型的方差分析表cTable 1 ANOVA of stepwise multiple regression modelc

表2 多元逐步回歸模型的偏回歸系數(shù)及其t 檢驗(yàn)Table 2 Coefficients of stepwise multiple regression model

3 結(jié)論

由以上研究表明，超臨界CO2萃取南極磷蝦蝦青素的適宜工藝條件為:萃取壓力為35 MPa，萃取溫度60 ℃，夾帶劑用量1.00 mL/g，萃取時(shí)間3.5 h，蝦青素得率達(dá)到84.41 ±0.57%。多元逐步回歸的模型的建立，得到最優(yōu)模型為Y = 4. 896 +44.984A+0.952C，結(jié)果顯示，夾帶劑用量和萃取溫度對(duì)蝦青素的提取效果有著顯著性影響。本研究為超臨界超二氧化碳萃取南極磷蝦蝦青素提供基礎(chǔ)理論依據(jù)，增加資源的附加值，促進(jìn)加工企業(yè)的發(fā)展和漁業(yè)資源的可持續(xù)利用，使其發(fā)揮更大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

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