楊舒文，趙 蓓，遲 翔，李金陽(yáng)，陳玉香，2*

(1.吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022;2.吉林大學(xué)工程仿生教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130022)

秸稈是農(nóng)作物經(jīng)收獲籽實(shí)、加工后的剩余物，其主要成分為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等有機(jī)質(zhì)［1］，農(nóng)作物光合作用生物產(chǎn)量的60%都存在于其中，因此蘊(yùn)藏著豐富的能量。目前我國(guó)秸稈資源并沒(méi)有得到合理有效的利用［2］，絕大部分被就地焚燒，造成了嚴(yán)重的能源浪費(fèi)和環(huán)境污染。在能源危機(jī)的大背景下，生物質(zhì)燃料的研發(fā)與生產(chǎn)日益受到重視，秸稈作為一種新型清潔的可再生能源［3］，具有潛在優(yōu)勢(shì)，探索高效降解秸桿的途徑是有效利用秸桿類(lèi)生物資源的前提。自然界中細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌等微生物都可以分解利用秸稈類(lèi)木質(zhì)纖維素。研究表明，好氧細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶組分較為單一，并且在自然界中含量較少;厭氧細(xì)菌所占比例較大但生長(zhǎng)困難［4］。厭氧真菌可產(chǎn)生一個(gè)獨(dú)特的多酶復(fù)合體系，在纖維素降解過(guò)程中具有較強(qiáng)優(yōu)勢(shì)［5］。因此現(xiàn)在研究的多為真菌，例如使用綠色木霉產(chǎn)生的纖維素酶進(jìn)行纖維素的酶解糖化在美國(guó)已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)［6］。目前國(guó)內(nèi)外主要研究單一菌株產(chǎn)纖維素酶的能力［7］，在自然界中，木質(zhì)纖維素是在各種微生物的協(xié)同作用下被降解利用的，因此在選擇菌種時(shí)應(yīng)充分考慮菌株之間的協(xié)同作用，發(fā)揮菌系的優(yōu)勢(shì)。另外，國(guó)內(nèi)外對(duì)纖維素酶及木聚糖酶的研究都已經(jīng)相對(duì)充分［8］，而對(duì)于降解半纖維素側(cè)鏈中乙?；囊阴ｕッ秆芯枯^少。由于木質(zhì)纖維素通常高度乙?；罅旷ユI而形成空間位阻，阻礙了纖維素酶、半纖維素酶與底物的結(jié)合［9］，而乙酰酯酶可以催化水解乙酰基與半纖維素分子間形成的酯鍵，有利于破壞植物細(xì)胞壁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)對(duì)其他糖苷水解酶發(fā)揮作用起到促進(jìn)作用［10］。在反芻動(dòng)物的瘤胃液中，微生物分泌的乙酰酯酶，已被證明是消除飼料細(xì)胞壁中半纖維素交聯(lián)酯鍵的關(guān)鍵酶［11］，并可以與纖維素酶、木聚糖酶協(xié)同作用，最大程度地利用自然界中的纖維類(lèi)粗飼料資源［12］。課題組以瘤胃微生物為研究對(duì)象，構(gòu)建了一組真菌菌系。本文研究了該菌系產(chǎn)生的乙酰酯酶的酶學(xué)性質(zhì)，旨在為乙酰酯酶的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 瘤胃液取自吉林省皓月集團(tuán)。將保溫瓶預(yù)先滅菌，收集新鮮屠宰的肉牛瘤胃液，經(jīng)4層紗布過(guò)濾后低溫保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基:每1 L含NaHCO35 g，葡萄糖 1 g，酵母膏 1 g，蛋白胨 1 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽1.5 g，無(wú)細(xì)胞瘤胃液170 mL，緩沖液330 mL(A液、B液各165 mL);產(chǎn)酶培養(yǎng)基:每1 L含NaHCO35 g，酵母膏1 g，蛋白胨1 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽1.5 g，無(wú)細(xì)胞瘤胃液170 mL，緩沖液330 mL(A液、B液各165 mL);緩沖液(pH為6.8):由A、B液組成，其中每1 L A液含KH2PO43 g，CaCl2·2H2O 0.4 g，NaCl 6 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，(NH4)2SO43 g。每1 L B液含K2HPO4·3H2O 4 g;無(wú)細(xì)胞瘤胃液的獲取:4層紗布過(guò)濾的新鮮牛瘤胃液，于4000 r/min，4℃離心30 min后取上清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 乙酰酯酶活力分析 將厭氧真菌菌系接種在種子培養(yǎng)基，置于厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)39℃培養(yǎng)3 d。將活化后的菌系接種在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基上。以無(wú)菌蒸餾水代替厭氧真菌菌系接種于培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)作為空白對(duì)照。每天定時(shí)取樣測(cè)定酶活力，連續(xù)7 d，分析乙酰酯酶活力動(dòng)態(tài)變化。乙酰酯酶酶活力測(cè)定方法如下:于4℃、2000×g條件下將發(fā)酵液離心，得到的上清即為粗酶液。將2 mmol/L對(duì)-硝基苯乙酯、50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)和經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶液于39℃下保溫15 min 后，50 μL 粗酶液中加入 50 μL 對(duì)-硝基苯乙酯和100 μL磷酸鈉緩沖液，39℃下反應(yīng)30 min，然后檢測(cè)415 nm下的吸光度，依據(jù)對(duì)-硝基苯標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出乙酰酯酶活力。1個(gè)酶活力單位(U)定義為在上述反應(yīng)條件下，1 min內(nèi)每1.0 mL酶液將1 μmol對(duì)-硝基苯從對(duì)-硝基苯乙酯中釋放出來(lái)所需的酶量。

1.2.2 測(cè)定乙酰酯酶最適溫度 將1.2.1中的反應(yīng)溫度用31、33、35、37、39、41 和 43 ℃替代，測(cè)出各溫度下乙酰酯酶的活力大小，并且計(jì)算出相對(duì)酶活力。

1.2.3 測(cè)定乙酰酯酶最適pH 將1.2.1中使用的緩沖液用 pH 4.0～5.0檸檬酸鈉緩沖液(50 mmol/L)，pH 6.0 ～8.0 磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L)和 pH 9.0～10.0甘氨酸-NaOH 緩沖液(50 mmol/L)替代，測(cè)出各pH下乙酰酯酶活力，并計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.2.4 金屬離子對(duì)乙酰酯酶活力影響 將4.0 mmol/L CoCl2、FeCl3、MgSO4、NiCl2、KCl、FeSO4和CaCl2儲(chǔ)液和相同體積的粗酶液混合，39℃保溫30 min后，測(cè)定乙酰酯酶活力，并計(jì)算相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酰酯酶活力動(dòng)態(tài)分析

圖1為乙酰酯酶活力動(dòng)態(tài)分析。由圖1可知，乙酰酯酶活力先持續(xù)增大，在第3天時(shí)達(dá)到最高酶活力0.96 U/mL，到第4天時(shí)開(kāi)始下降?？傏厔?shì)與陳靜等［13］報(bào)道的瘤胃液中分離得到的細(xì)菌菌株RB1所產(chǎn)乙酰酯酶活力動(dòng)態(tài)變化相似，但是其最大酶活力低于該厭氧菌系。曹陽(yáng)春等［14］報(bào)道的瘤胃厭氧真菌Neocallimastix frontalis所產(chǎn)的乙酰酯酶活力最高為0.165 U/mL，也低于該厭氧菌系最高酶活力。這表明真菌菌系相對(duì)于單一菌株具有更高的產(chǎn)酶活力。

圖1 乙酰酯酶活力動(dòng)態(tài)Fig.1 Time courses of acetyl esterase

2.2 乙酰酯酶的最適溫度

溫度對(duì)乙酰酯酶活力的影響如圖2所示。由圖2可知，乙酰酯酶的最適溫度為41℃。菌株RB1乙酰酯酶的最適溫度為40℃［11］，瘤胃厭氧真菌Orpinomyces sp.PC-2乙酰酯酶的最適溫度為30℃［15］。比較可以看出，來(lái)自瘤胃液中的不同微生物所產(chǎn)乙酰酯酶的最適溫度差別較大。

圖2 溫度對(duì)乙酰酯酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of acetyl esterase

2.3 乙酰酯酶的最適pH

pH對(duì)乙酰酯酶活力影響如圖3所示。由圖3可知，該厭氧真菌菌系所產(chǎn)的乙酰酯酶最適pH為9.0，耐受pH值范圍較窄。在pH低于6時(shí)，酶活力基本喪失，在pH 7.0時(shí)，相對(duì)酶活力為22%，pH 10.0時(shí)，相對(duì)酶活力為16%。在對(duì)Streptomyces sp.PC22的研究表明，所產(chǎn)乙酰酯酶的最適 pH范圍為6.5～7.0［7］。菌株 RB1所產(chǎn)乙酰酯酶最適pH為8.0，略低于該真菌菌系所產(chǎn)乙酰酯酶的最適pH［9］。對(duì)瘤胃真菌菌株Neocallimastix sp.YQ2的研究顯示，所產(chǎn)乙酰酯酶最適pH為8.0，低于本研究中乙酰酯酶最適pH［16］。不同來(lái)源的乙酰酯酶的最適 pH明顯不同。

圖3 pH對(duì)乙酰酯酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of acetyl esterase

2.4 各種金屬離子對(duì)乙酰酯酶活力影響

金屬離子對(duì)乙酰酯酶的影響如表1所示。由表1可知，Mg2+、K+、Ca2+對(duì)酶有一定的激活作用，其中Mg2+對(duì)乙酰酯酶的促進(jìn)作用最明顯;而Co2+、Ni2+、Fe2+對(duì)酶有一定的抑制作用，其中Fe3+幾乎完全抑制酶的活力。Degrassi等［17］研究了金屬離子對(duì)Bacillus pumilus所產(chǎn)乙酰酯酶活力影響，10 mmol/L 的 Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Ca2+明顯抑制其活力，而 2 mmol/L時(shí)沒(méi)有影響。Chungool等［11］研究 Streptomyces sp.PC22 在純培養(yǎng)液中所產(chǎn)生的乙酰酯酶，發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L的Zn2+和 Cu2+抑制乙酰酯酶的活力，但 Mn2+、Ca2+、Co2+、Mg2+和 Ca2+沒(méi)有明顯的促進(jìn)或抑制作用。說(shuō)明不同來(lái)源的乙酰酯酶的酶學(xué)特性存在一定差異，綜合文獻(xiàn)報(bào)道及本文研究結(jié)果，Ca2+表現(xiàn)出激活或者抑制作用，而Co2+均表現(xiàn)為抑制作用。

表1 金屬離子對(duì)乙酰酯酶活力影響Table 1 Effect of metal ions on the activity of acetyl esterase

3 討論

本研究采用厭氧培養(yǎng)牛瘤胃液厭氧真菌菌系，對(duì)該菌系所產(chǎn)乙酰酯酶粗酶液，進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀、透析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾得到純化后的乙酰酯酶，研究其酶學(xué)性質(zhì)。由酶活力動(dòng)態(tài)分析得出乙酰酯酶在產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)至第3天酶活力達(dá)到最高，最高酶活力為0.96 U/mL，與其他文獻(xiàn)對(duì)比得知，該菌系所產(chǎn)乙酰酯酶活力較高。該乙酰酯酶最適溫度為41℃，最適pH為9.0，Mg2+、K+、Ca2+對(duì)酶有一定的激活作用，F(xiàn)e3+對(duì)酶有很強(qiáng)的抑制作用。乙酰酯酶是消除細(xì)胞壁中半纖維素交聯(lián)酯鍵的關(guān)鍵酶，與纖維素酶、木聚糖酶等具有協(xié)同作用，從而最大限度地降解木質(zhì)纖維素物質(zhì)，在降解含有大量乙酰木聚糖的農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物過(guò)程中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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