彌 娜 劉光偉 李 昕 李堯華 于 順

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室 北京市老年病醫(yī)療研究中心分子診斷實(shí)驗(yàn)室 教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053)

α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)的異常聚集被認(rèn)為在帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的發(fā)病中起重要作用［1-3］。α-Syn在神經(jīng)元的積聚和聚集與其降解通路發(fā)生障礙有關(guān)。最新研究［4-6］表明，α-Syn的降解主要通過伴侶分子介導(dǎo)的自噬(chaperonemediated autophagy，CMA)進(jìn)行。CMA是溶酶體自噬系統(tǒng)中的一種選擇性的胞質(zhì)蛋白降解途徑。最新的研究［7-8］結(jié)果表明，CMA對α-Syn的降解需要葡糖腦苷脂酶(glucocerebrosidase，GBA)的正?；钚?。能夠引起戈謝病的GBA失功能突變可以增加PD及相關(guān)突觸核蛋白病(synucleinopathy)的患病風(fēng)險(xiǎn)。在戈謝病小鼠模型，伴隨GBA活性的嚴(yán)重下降，小鼠不同腦區(qū)出現(xiàn)明顯的α-Syn聚集［9］。而下調(diào)GBA活性可以導(dǎo)致溶酶體蛋白降解能力下降以及隨后的α-Syn聚集和依賴于α-Syn聚集的神經(jīng)毒性作用［10］。已知，PD的神經(jīng)病理變化具有明顯的部位選擇性。對紋狀體和小腦的分析結(jié)果表明，PD患者紋狀體的線粒體中的α-Syn水平顯著高于小腦的線粒體的α-Syn水平，并伴有線粒體復(fù)合酶I活性的降低，后者是PD患者線粒體變化的重要特征［11］。我們推測，α-Syn在局部腦組織的聚集可能與該部位CMA的活性有關(guān)，其中GBA在局部的表達(dá)水平和活性可能影響局部α-Syn含量。在本研究中，我們以非人靈長類動物食蟹猴為模型，觀察PD敏感腦區(qū)紋狀體和PD非敏感腦區(qū)小腦皮質(zhì)α-Syn與CMA降解有關(guān)的蛋白質(zhì)GBA的表達(dá)及其相互關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康食蟹猴(3～4歲)5只，購自廣西雄森靈長類動物養(yǎng)殖中心，實(shí)驗(yàn)動物許可證號:SYXK桂2009－0006，所有動物均有詳細(xì)出生檔案和檢疫證書，動物研究方案經(jīng)實(shí)驗(yàn)動物福利委員會(Institutional Aniamal Care and Use Committee，IACUC)認(rèn)定批準(zhǔn)。鼠抗人α-Syn單克隆抗體3D5由本室制備［12］，兔抗人GBA單克隆抗體(Epitomics公司)，生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG、生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、鏈霉親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(購自中杉公司)，streptavidin-Cy3(Sigma公司)，β-葡糖腦苷脂酶活性檢測試劑盒(BioAssay Systems公司)，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(PIERCE Biotech公司)。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting方法

將猴腦組織在組織裂解液［13］中研磨、裂解，12 000 g于4℃離心30 min。收取上清獲得全細(xì)胞勻漿。BCA法測定蛋白濃度。按每個(gè)泳道80 μg總蛋白上樣，SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，半干法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。PVDF膜 首 先 分 別 與 抗 α-Syn(3D5)(1 ∶2 000)及抗 GBA(1 ∶5 000)抗體反應(yīng)過夜，然后與相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠或抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h。辣根過氧化物酶活性用ECL試劑盒檢測。

1.2.2 葡糖腦苷脂酶活性分析

按照GBA酶活性檢測試劑盒提供的方法，將上述方法制備的腦勻漿樣品加入96孔板中，再分別加入超純水和酶活性試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)液、底物液、檢測緩沖液，酶標(biāo)儀測定在405 nm波長的反應(yīng)前(0 min)和反應(yīng)30 min后的吸光度值。GBA酶活性=［(OD30min－OD0min)/(OD標(biāo)準(zhǔn)液－OD水)］×250(U/L)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法

將猴腦組織制成石蠟切片，依次進(jìn)行脫蠟、檸檬酸鹽緩沖液抗原熱修復(fù)、PBST通透性處理和正常羊血清封閉，然后分別與抗α-Syn單克隆抗體3D5(1∶200)和抗GBA(1∶200)抗體室溫反應(yīng)過夜，與生物素標(biāo)記山羊抗鼠或山羊抗兔IgG(1∶200)室溫反應(yīng)2 h，最后與鏈霉親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶(1∶100)室溫反應(yīng)1 h，DAB顯色。切片經(jīng)脫水透明、封片后，在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.4 免疫熒光雙重標(biāo)記法

將切片依次經(jīng)過脫蠟、抗原熱修復(fù)、通透性處理和正常羊血清封閉后，與抗GBA(1∶200)+抗α-Syn單克隆抗體3D5(1∶200)室溫反應(yīng)過夜，與生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶100)室溫反應(yīng)1 h，最后與FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(1:100)和 streptavidin-Cy3(1∶200)室溫避光反應(yīng)1 h，DAPI染核封片，熒光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

5只動物，每只動物重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。采用SPSS17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用配對樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 α-Syn在紋狀體和小腦的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，α-Syn在紋狀體和小腦部位均有表達(dá)。α-Syn免疫活性物質(zhì)呈細(xì)小的顆粒狀，主要存在于神經(jīng)末梢中，僅有少數(shù)神經(jīng)元胞體呈α-Syn陽性反應(yīng)(圖1A)。Western blotting結(jié)果顯示，α-Syn在紋狀體的表達(dá)量明顯高于小腦(圖1B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖1C)。

2.2 GBA在紋狀體和小腦的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，GBA在紋狀體和小腦部位均有表達(dá)。GBA免疫活性物質(zhì)呈細(xì)小的顆粒狀存在于神經(jīng)元的胞質(zhì)中，但也有少量顆粒狀的陽性結(jié)構(gòu)散在分布，這些陽性結(jié)構(gòu)是GBA免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)末梢(圖2A)。Western blotting結(jié)果顯示，GBA在紋狀體的表達(dá)量低于小腦(圖2B)，且二者的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(圖2C)。

2.3 α-Syn和GBA在紋狀體和小腦的共定位

免疫熒光雙重標(biāo)記顯示，在紋狀體和小腦浦肯野細(xì)胞層和顆粒細(xì)胞層，均有GBA免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)(綠色熒光)與α-Syn免疫反應(yīng)陽性物質(zhì) (紅色熒光)重疊。二者的重疊不僅見于神經(jīng)元的胞體，也見于呈顆粒狀分布的神經(jīng)末梢(圖3)。

2.4 GBA在紋狀體和小腦的活性

我們分別測定了紋狀體和小腦提取物中的GBA的活性。結(jié)果表明，紋狀體的GBA活性明顯低于小腦，二者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖4)。

圖3 α-Syn和GBA在紋狀體和小腦的共定位Fig.3 Colocalization of α-Syn and GBA in striatum and cerebellum

圖4 GBA在紋狀體和小腦的活性Fig.4 Enzyme activity assay of GBA in striatum and cerebellum

3 討論

已知，GBA是PD的風(fēng)險(xiǎn)基因，分子遺傳學(xué)研究［14］表明，PD患者的GBA基因突變率明顯高于正常對照。編碼GBA的基因突變以及由此引起的神經(jīng)鞘磷脂代謝改變與PD的發(fā)病有關(guān)［15-16］。GBA基因突變后通過削弱溶酶體的蛋白降解能力而引起α-Syn和葡糖腦苷脂(GBA底物)積聚，后者通過直接穩(wěn)定α-Syn寡聚中間體而影響其在神經(jīng)細(xì)胞的積聚［10］。本研究結(jié)果表明，PD易感腦區(qū)紋狀體的α-Syn水平高于非易感腦區(qū)小腦。相反，參與α-Syn降解的GBA的水平和酶活性在紋狀體卻低于小腦。鑒于GBA參與α-Syn的降解，其在紋狀體部位含量的降低和活性低下很可能是紋狀體部位α-Syn含量較高的原因。

已知，α-Syn是一種易于聚集的蛋白質(zhì)，其聚集依賴于其局部濃度［17］。因此，α-Syn在紋狀體含量較高是導(dǎo)致該部位α-Syn易于聚集的原因。有文獻(xiàn)［7］表明，α-Syn水平增高可以抑制GBA在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致溶酶體的GBA活性下降。

本文的研究結(jié)果提示，除了遺傳因素導(dǎo)致GBA突變外，GBA在正常腦組織不同部位表達(dá)水平和活性的差異很可能是局部腦組織α-Syn含量不同的原因。紋狀體由于GBA的含量和活性較低，導(dǎo)致α-Syn在該部位的降解速度緩慢，從而導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)積聚和聚集。這可能是紋狀體在PD患者易于受累的原因之一。然而在正常情況下，聚集的α-Syn含量尚不足以達(dá)到致病水平，某些遺傳和環(huán)境因素可能加速α-Syn的聚集，從而誘發(fā)帕金森病。

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