孔旭東，郁惠蕾，周佳海，許建和

(1.華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237;2.中國(guó)科學(xué)院 上海有機(jī)化學(xué)研究所 生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200036)

目前，臨床上所用的藥物很大一部分具有手性。由于酶和細(xì)胞表面受體都具有手性，外消旋藥物進(jìn)入人體后，2種對(duì)映體在人體內(nèi)的藥理活性、代謝過(guò)程及毒性往往存在顯著的差異。手性環(huán)氧化物及其開(kāi)環(huán)產(chǎn)物鄰位二醇由于可以與多種親核試劑如醇、胺、羥胺、肼、鹵素、腈等反應(yīng)，從而成為有機(jī)合成中一類非常重要的手性合成砌塊，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、香料和精細(xì)化學(xué)品工業(yè)等方面都有著重要的應(yīng)用價(jià)值。如利用手性縮水甘油衍生物與胺的反應(yīng)可合成一大類重要的心血管藥物β－腎上腺素阻斷劑，包括普萘洛爾、阿替洛爾、比索洛爾等幾十個(gè)品種［1－2］。此外，手性環(huán)氧前體可用于合成抗肥胖藥物(L－肉堿)、抗艾滋病藥物(茚地那韋)、鈣通道阻滯藥(地爾硫卓)、昆蟲(chóng)信息素(Frontalin)等等［3］。

手性環(huán)氧化物與其開(kāi)環(huán)產(chǎn)物鄰位二醇可通過(guò)多種生物轉(zhuǎn)化方法合成，包括單加氧酶或過(guò)氧化物酶催化的烯烴不對(duì)稱環(huán)氧化、脫鹵酶催化的環(huán)氧拆分、環(huán)氧水解酶(epoxide hydrolases，簡(jiǎn)稱 EHs，EC 3.3.2.3)催化外消旋環(huán)氧化物的水解拆分或?qū)τ硽w一性水解。EHs廣泛存在于哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)和微生物等幾乎所有生物體內(nèi)。最初在20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)環(huán)氧水解酶是由于其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)對(duì)毒性環(huán)氧類物質(zhì)的代謝功能［4］。其在生物體內(nèi)的主要生理功能包括:在哺乳動(dòng)物體內(nèi)降解毒性環(huán)氧化物的解毒功能、在植物和昆蟲(chóng)中參與含環(huán)氧類信號(hào)分子的代謝與調(diào)控以及參與微生物環(huán)氧類碳源的代謝等［5］。20世紀(jì)90年代后對(duì)微生物來(lái)源EHs的廣泛研究解決了EHs來(lái)源的問(wèn)題，使它在手性環(huán)氧化物生物合成中的應(yīng)用成為研究熱點(diǎn)。作為生物催化劑，EHs具有反應(yīng)時(shí)不需要金屬離子和輔酶、酶的來(lái)源廣泛、對(duì)映選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于手性環(huán)氧化物及鄰位二醇的合成。筆者主要從EHs的結(jié)構(gòu)與功能、新型EHs的篩選及改造等方面綜述了EHs在生物催化領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

1 EHs結(jié)構(gòu)與功能

1.1 α/β 水解酶折疊EHs

第一個(gè)EHs的三維結(jié)構(gòu)(ArEH，PDBID:1EHY)于1999由Nardini等［6］發(fā)現(xiàn)，它來(lái)源于放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter AD1)，與哺乳動(dòng)物來(lái)源的sEH具有同源性。ArEH屬α/β水解酶家族，其催化結(jié)構(gòu)由α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)域和1個(gè)蓋子結(jié)構(gòu)域組成(圖 1a)，來(lái)自于 α/β 結(jié)構(gòu)域的 Asp107、His275與Asp246所組成的催化三聯(lián)體位于這2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間，目前所發(fā)現(xiàn)的大部分EHs均屬于這一家族。該晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道首次確定了位于蓋子結(jié)構(gòu)域中的2個(gè)酪氨酸Tyr152/Tyr215在催化過(guò)程中與底物結(jié)合和輔助環(huán)氧開(kāi)環(huán)作用。幾乎與之同時(shí)，Argiriadi等［7］報(bào)道了來(lái)源于鼠(Mus musculus)的MssEH(PDBID:1CQZ)晶體結(jié)構(gòu)，它的C端具有與ArEH類似的α/β結(jié)構(gòu)域與蓋子結(jié)構(gòu)域，雖然蓋子結(jié)構(gòu)域中α－h(huán)elix的構(gòu)象存在一定差別，但其中的2個(gè)Tyr的位置非常一致，進(jìn)一步證明了它們參與了催化反應(yīng)。該結(jié)構(gòu)中活性位點(diǎn)位于1個(gè)L形通道中，與它所催化的長(zhǎng)鏈脂肪酸環(huán)氧化物非常吻合。在它的N端還包含1個(gè)不具有催化功能的結(jié)構(gòu)域，對(duì)MssEH二聚體的形成起重要作用。第3個(gè)α/β水解酶類的EH結(jié)構(gòu)是來(lái)源于黑曲霉(Aspergillus niger)的 AnEH［8］，雖然它與哺乳動(dòng)物微粒體EHs(mEH)同源性更高，但缺乏膜錨定結(jié)構(gòu)域，因此是一種可溶性的EHs。AnEH中類似于mEH的典型N－末端延伸區(qū)域，從α/β水解酶結(jié)構(gòu)域的底部開(kāi)始形成幾個(gè)連續(xù)的α－h(huán)elix環(huán)繞到蓋子結(jié)構(gòu)域的頂部，從而保持蓋子結(jié)構(gòu)域與α/β水解酶結(jié)構(gòu)域更緊密的貼合。從2004年至今陸續(xù)又有3個(gè)α/β水解酶類EH晶體結(jié)構(gòu)被報(bào)道，分別是來(lái)源于人(Homo sapiens)的 HssEH(PDB ID:1S8O)、來(lái)源于土豆(Solanum tuberosum)的StEH(PDB ID:2CJP)和來(lái)源于結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的 MtEHA(PDB ID:2BNG)。其中HssEH與mssEH非常相似，由N端的退化磷酸酶結(jié)構(gòu)域和C端的環(huán)氧水解酶結(jié)構(gòu)域組成。

自20世紀(jì)70年代EHs被發(fā)現(xiàn)后，EHs的催化機(jī)理就受到了廣泛深入的研究［9］。到 1993年Lacourciere等［10］測(cè)定了在O環(huán)境下微粒體EHs單次轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物中放射性積累，他們同時(shí)結(jié)合了當(dāng)時(shí)最新發(fā)表的脫鹵酶晶體結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制以及其與mEH在序列上的相似性，提出的現(xiàn)在所普遍接受的催化機(jī)理(圖1(d))。其中Asp在催化反應(yīng)的第一步中作為親核試劑進(jìn)攻環(huán)氧碳原子，與底物形成酯中間體，其余2個(gè)殘基His與Asp通過(guò)奪取水分子中的質(zhì)子，產(chǎn)生OH－親核進(jìn)攻酯中間體發(fā)生水解，釋放鄰位二醇完成催化反應(yīng)的第二步。水解過(guò)程中酯中間體的羰基氧所形成的氧負(fù)離子與空間上鄰近的2個(gè)主鏈氨基組成的氧洞，從而形成穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)。到1999年ArEH晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道進(jìn)一步確認(rèn)了這一機(jī)理，同時(shí)發(fā)現(xiàn)催化反應(yīng)還涉及2個(gè)來(lái)自帽子結(jié)構(gòu)域的Tyr，通過(guò)與環(huán)氧氧原子形成氫鍵增加其電負(fù)性，起著固定底物結(jié)合位置和輔助環(huán)氧開(kāi)環(huán)的作用。

1.2 白三烯A4水解酶

第一個(gè)非α/β水解酶類EHs的晶體結(jié)構(gòu)(來(lái)源于人的LTA4水解酶)于2001年由Thunnissen等［11］解析得到，是目前報(bào)道的唯一一個(gè)將環(huán)氧水解后產(chǎn)生非鄰位二醇的EH。其結(jié)構(gòu)屬于α－α超螺旋折疊，由N端結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域三部分組成(圖1b)。催化結(jié)構(gòu)域具有嗜熱蛋白酶結(jié)構(gòu)特征，包含一個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)具有白三烯A4水解酶和氨基肽酶活性。結(jié)合模擬與定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以確定其催化機(jī)理(圖1e)，反應(yīng)發(fā)生時(shí)配位結(jié)合于His295、His299與Glu318的Zn2+作為L(zhǎng)wies酸介導(dǎo)環(huán)氧開(kāi)環(huán)，產(chǎn)生的C6碳正離子由白三烯中的共軛三烯傳遞至C12，隨后從Asp375活化的水分子中奪取羥基完成水解反應(yīng)。

圖1 EHs催化機(jī)制Fig.1 Catalytic mechanism of epoxide hydrolases

1.3 檸檬烯1，2－EHs

2003年，Arand等［12］解析了來(lái)源于紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)的檸檬烯 1，2－EHs(limonene-1，2-epoxide hydrolase，LEH)的 3D 結(jié)構(gòu)(PDB ID:1HS6)，它屬于一類新的EHs，大小僅149個(gè)氨基酸。屬于這一類EHs的晶體結(jié)構(gòu)還包括結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的MtEHA(PDB ID:2BNG)和在鏈霉菌(Streptomyces lasaliensis)中參與聚醚合成的lsd19(PDB ID:3RGA)。它們的結(jié)構(gòu)特征是具有1個(gè)由4個(gè)α－螺旋和6個(gè)高度彎曲的β－折疊所組成α/β桶狀結(jié)構(gòu)，桶的內(nèi)側(cè)形成1個(gè)深入蛋白內(nèi)部的底物結(jié)合口袋，其催化殘基包括位于底部的兩個(gè)Asp與位于兩者之間的Arg，口袋其余部分主要由疏水性殘基所組成(圖1c)。與第一類EHs相比，LEH催化機(jī)制僅包含一步反應(yīng)(圖1f)。在Tyr53與 Asn55的輔助下，由Asp132奪取水中的1個(gè)質(zhì)子，產(chǎn)生的OH親核進(jìn)攻環(huán)氧，與此同時(shí)Asp101將質(zhì)子傳遞給環(huán)氧氧原子。反應(yīng)結(jié)束后Asp132再將質(zhì)子通過(guò)Arg99傳回Asp101，使酶回到初始狀態(tài)。由于LEH通過(guò)單步反應(yīng)完成水解，不涉及底物與酶的中間體狀態(tài)，因此LEH類EHs有可能接受水以外的親核試劑如N3－、NO2－、CN－、Cl－、Br－、I－、OCN－、SCN－、HCOO－等實(shí)現(xiàn)環(huán)氧開(kāi)環(huán)，獲得除二醇以外的其他產(chǎn)物［13］。

1.4 EHs的立體選擇性

對(duì)于α/β水解酶折疊EHs和LEH類EHs，在水解外消旋環(huán)氧化物過(guò)程中同時(shí)存在對(duì)映選擇性和區(qū)域選擇性問(wèn)題。特定的EH可能優(yōu)先催化R型或S型底物的水解，存在對(duì)映選擇性，可用于對(duì)消旋底物進(jìn)行拆分(圖2)。同時(shí)對(duì)于單獨(dú)的R型底物，當(dāng)EH進(jìn)攻有取代的α碳原子時(shí)，產(chǎn)物構(gòu)型發(fā)生翻轉(zhuǎn)產(chǎn)生S型二醇，而當(dāng)進(jìn)攻無(wú)取代的β碳原子時(shí)，產(chǎn)物構(gòu)型保留生成R型二醇。因此，當(dāng)催化兩種構(gòu)型的底物以相反的位置選擇性進(jìn)行水解時(shí)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)消旋環(huán)氧化物的對(duì)映歸一性水解獲得單一構(gòu)型的二醇產(chǎn)物。這一過(guò)程可通過(guò)使用具有互補(bǔ)選擇性的EHs或先后采用酶法和化學(xué)法催化環(huán)氧水解的方法實(shí)現(xiàn)。如利用Aspergillus niger和Bacillus suffurescens菌株可對(duì)氧化苯乙烯進(jìn)行對(duì)映歸一性水解獲得89%e.e.和 92% 的收率［14］。而植物來(lái)源的土豆StEH［15］和綠豆 mbEH［16］分別可單獨(dú)催化氧化苯乙烯和對(duì)硝基氧化苯乙烯的對(duì)映歸一性水解。Furstoss等［17］利用 Aspergillus niger粗酶與酸水解的方法用消旋的對(duì)硝基氧化苯乙烯制備了相應(yīng)的R型二醇，并最終以99%e.e.和58%收率合成了RNifénalol? 。

圖2 EHs區(qū)域選擇性Fig.2 Regioselectivity of epoxide hydrolases

2 新型EHs生物催化劑的開(kāi)發(fā)

2.1 傳統(tǒng)篩選方法

自20世紀(jì)90年代起人們對(duì)微生物來(lái)源的EHs進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)了大批能夠選擇性水解環(huán)氧化物的細(xì)菌、真菌菌株，解決了EHs的酶源問(wèn)題。最初的篩選主要從已保藏的菌株出發(fā)檢測(cè)其EHs活性，優(yōu)先選擇能夠有效降解烯烴的菌株(能水解由此產(chǎn)生的環(huán)氧中間體)或能耐受環(huán)氧化物毒性的菌株。而以環(huán)氧底物作為唯一C源對(duì)土壤試樣進(jìn)行富集培養(yǎng)篩選或逐步提高底物濃度進(jìn)行馴化篩選，可針對(duì)特定底物從自然界中廣泛篩選EHs產(chǎn)生菌株。

自1993 年起，Mischitz等［18－19］篩選到一批具有環(huán)氧化物水解酶活性的細(xì)菌菌株，并做了一系列報(bào)道，包括大量菌株的底物譜鑒定、利用EHs進(jìn)行制備規(guī)模的手性合成、EHs固定化、EHs催化的對(duì)映歸一性水解等，充分證明了細(xì)菌EHs在有機(jī)合成中的應(yīng)用潛力。法國(guó)的Zocher等［20］也針對(duì)產(chǎn)EHs的真菌菌株進(jìn)行了相應(yīng)的工作，其中Aspergillus niger表達(dá)的EHs此后被深入研究并已實(shí)現(xiàn)了商品化。Zocher等［20］測(cè)定了120株鏈霉菌對(duì)氧化苯乙烯的活性及選擇性，從中篩選到Streptomyces antibioticus Tü4對(duì)映選擇性E值達(dá)31，并且與大部分之前報(bào)道的菌株具有互補(bǔ)的對(duì)映選擇性。國(guó)內(nèi)最早由華東理工大學(xué)許建和課題組從土壤中篩選得到1株細(xì)菌Bacillusmegaterium ECU1001和 1株真菌Trichosporon loubierii ECU1040，它們對(duì)苯基縮水甘油醚具有互補(bǔ)的對(duì)映選擇性，E值分別達(dá)到47.8和65.8［21－22］。山東大學(xué) Li 等［23］利用 Pseudomonas sp.整細(xì)胞拆分3－苯基環(huán)氧乙烷甲酸乙酯達(dá)到了95%e.e.s和25%的收率。浙江工業(yè)大學(xué)鄭裕國(guó)課題組分離得到的Rhodococcus sp.ML－0004菌株可用于催化水解順式－環(huán)氧琥珀酸生產(chǎn)L－酒石酸［24］。至今為止，已有大量微生物菌株和植物被篩選到具有環(huán)氧水解酶活性，微生物主要來(lái)自于Agrobacterium、Aspergillus、 Bacillus、 Beauveria、 Corynebacterium、Pseudomonas、Rhodococcus、Rhodosporidium、Rhodotorula、Streptomyces、Trichosporon等屬，植物來(lái)源包括了土豆、大豆、綠豆、擬南芥等。其中對(duì) Agrobacterium radiobacter AD1、 Aspergillus niger、 Rhodococcus erythropolis、Solanum tuberosum、Rhodotorula glutinis等來(lái)源的EHs研究最為深入，目前均已進(jìn)行了重組表達(dá)，并且Aspergillus niger EH已有商品酶銷售。

2.2 基因工程挖掘方法

近20年來(lái)，人們已從自然界篩選得到了大量產(chǎn)EHs的微生物，但是由于野生菌表達(dá)的EHs往往只占其總蛋白的一小部分并且可能同時(shí)存在多個(gè)不同選擇性的EHs，因而存在產(chǎn)酶活力低及對(duì)映體選擇性不高等問(wèn)題。對(duì)野生菌株進(jìn)行產(chǎn)酶優(yōu)化非常耗時(shí)，而且對(duì)酶進(jìn)行分離純化的過(guò)程易導(dǎo)致酶活損失。因此，人們把目光投向了如何獲得高對(duì)映體選擇性的EHs和高產(chǎn)EHs的菌株。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展、基因序列信息的積累以及基因工程技術(shù)的進(jìn)步，快速獲得新的EHs基因已成為可能。許多經(jīng)典的 EHs都已被克隆并重組表達(dá)，如 Aspergillus niger、Agrobacterium radiobacter、Rhodococcus glutinis和Solanum tuberosum來(lái)源的EHs。隨著EHs測(cè)序數(shù)量的增加，對(duì)其序列功能關(guān)系也有了更深入的了解，Barth等［25］分析了大量EHs序列與其結(jié)構(gòu)的關(guān)系，為從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘更多不同催化性質(zhì)的EHs提供了基礎(chǔ)。表1列舉了最近5年成功克隆表達(dá)的部分EHs及其基本催化性質(zhì)。

?

?

2.3 EHs分子改造

蛋白質(zhì)工程通過(guò)定向進(jìn)化或理性設(shè)計(jì)等方法可顯著地改變酶的活性和選擇性，而且可以擴(kuò)大酶的適用底物范圍，通過(guò)尋找新酶或應(yīng)用新觀點(diǎn)來(lái)擴(kuò)大EHs作為生物催化劑的范圍和性能，對(duì)擴(kuò)充現(xiàn)有生物合成工具庫(kù)非常有用。隨著對(duì)環(huán)氧化物水解酶結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的更深入理解，結(jié)合可用于更高效構(gòu)建突變體(庫(kù))的分子生物學(xué)方法和EHs活性的高通量檢測(cè)技術(shù)，對(duì)EHs的定向進(jìn)化與理性設(shè)計(jì)成為近幾年EHs領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

已有相關(guān)綜述討論了 EHs的高通量篩選方法［3，35］，包括:① UV/VIS 分光光度法，簡(jiǎn)便快速，但該靈敏度不高;②通過(guò)NaIO4氧化二醇，結(jié)合分光光度法或熒光光度法，測(cè)定產(chǎn)物二醇的量;③ NBP(4-(p-nitrobenzyl)pyridine)法，NBP能與環(huán)氧化物反應(yīng)生成紫色染料，可在600 nm處進(jìn)行檢測(cè);④ Reetz等開(kāi)發(fā)了用ESI－MS高通量測(cè)定EHs對(duì)映選擇性的方法，以1∶1混合的(R)－PGE(phenyl glycidyl ether)與氘代(S)－PGE作為底物，反應(yīng)后由于R和S構(gòu)型的底物或產(chǎn)物存在質(zhì)量差，因此其質(zhì)譜結(jié)果可確定底物和產(chǎn)物的e.e.值，從而確定對(duì)映選擇性;⑤ Loo等［35］以番紅O為指示劑，在含1，2－環(huán)氧丁烷的瓊脂平板上對(duì)定向進(jìn)化的菌株的EHs活力進(jìn)行篩選，通過(guò)菌落顏色挑選活性菌株。

Reetz等［36］最先針對(duì)AnEH的對(duì)映選擇性進(jìn)行了定向進(jìn)化，通過(guò)一輪易錯(cuò)PCR并用ESI－MS進(jìn)行高通量篩選，得到了突變體A217V/K332E/A390E，與WT(Wild type)相比對(duì)苯基縮水甘油醚的選擇性(E值)由4.5提高到了10.8。最近他們又利用以LacZα作為報(bào)告蛋白的藍(lán)色菌落篩選方法將AnEH的表達(dá)效率提高了近50倍。van Loo等［37］用易錯(cuò)PCR和同源重組的方法對(duì)ArEH進(jìn)行了定向進(jìn)化，產(chǎn)生的40000個(gè)克隆用番紅花紅O－瓊脂糖平板篩選活性突變體，得到的8827個(gè)活性突變體利用分光光度法測(cè)定對(duì)pNPGE(對(duì)硝基苯基縮水甘油醚)的水解進(jìn)程，通過(guò)轉(zhuǎn)化率超過(guò)50%后其催化速率的下降程度來(lái)判定突變體的對(duì)映選擇性，得到的突變體對(duì)映選擇性最高達(dá)WT的13倍。

隨著多個(gè)EHs晶體結(jié)構(gòu)的陸續(xù)報(bào)道，通過(guò)定點(diǎn)突變對(duì)EHs進(jìn)行理性或半理性設(shè)計(jì)也應(yīng)用到了Aspergillus niger、Solanum tuberosum 和 Agrobacterium radiobacter EHs的分子改造中。Nardini等［38］將ArEH中參與底物結(jié)合與環(huán)氧開(kāi)環(huán)的2個(gè)Tyr中的1個(gè)突變?yōu)镻he后使它對(duì)芳香類環(huán)氧化物的對(duì)映選擇性提高了2～5倍。Thomaeus等［39］采取半理性設(shè)計(jì)的方法，在ArEH的活性位點(diǎn)周?chē)x擇了3個(gè)殘基(Phe108，Ile219，Cys248)進(jìn)行飽和突變，得到的突變體對(duì)二氯環(huán)氧乙烷的活性提高了2.5～7倍。對(duì)土豆中StEH活性位點(diǎn)附近質(zhì)子傳遞鏈的突變Tyr149Phe和His153Phe，使它對(duì)反式二苯乙烯氧化物的對(duì)映選擇性提高了30倍。Reetz等［40］開(kāi)發(fā)的半理性設(shè)計(jì)方法CASTing(combinatorial active site saturation testing)，通過(guò)在活性位點(diǎn)附近按區(qū)域選擇殘基組合，分多輪重復(fù)進(jìn)行組合飽和突變，與傳統(tǒng)定向進(jìn)化相比縮小了突變庫(kù)，同時(shí)比理性設(shè)計(jì)具有更高的進(jìn)化效率。他們將該方法應(yīng)用于AnEH對(duì)映選擇性的改造，最終將 E值由 WT的4.6提高至115。Kotik等［41］采用類似方法嘗試對(duì) Aspergillus niger M200 EH進(jìn)行對(duì)映歸一性水解能力的進(jìn)化。通過(guò)5輪反復(fù)飽和突變，獲得的突變體能將氧化苯乙烯或?qū)β妊趸揭蚁┩耆?，e.e.值達(dá)到70%，將此突變體與WT結(jié)合使用可達(dá)到88%～91%e.e.。

2.4 筆者所在課題組在EHs開(kāi)發(fā)中的研究進(jìn)展

筆者所在課題組自1998年起開(kāi)展了對(duì)環(huán)氧水解酶生物催化劑的開(kāi)發(fā)及合成應(yīng)用方面的研究工作(表2)，獲得了一系列成果，包括針對(duì)縮水甘油苯基醚類底物從土壤中篩選到了具有互補(bǔ)對(duì)映選擇性的產(chǎn)EHs菌株巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)ECU1001及路比利絲孢酵母(Trichosporon loubierii)ECU1040。從植物中篩選到的綠豆環(huán)氧水解酶具有罕見(jiàn)的對(duì)映歸一性水解對(duì)硝基氧化苯乙烯的能力，可用于合成降血壓藥物R－Nifénalol?的手性前體。對(duì)于篩選得到的 EHs對(duì)其催化性能做了細(xì)致的表征，并通過(guò)產(chǎn)酶優(yōu)化、酶或細(xì)胞固定化、反應(yīng)體系優(yōu)化等方式實(shí)現(xiàn)了在多種手性化合物合成中的應(yīng)用。此外，近年來(lái)還成功克隆表達(dá)了來(lái)自Bacillus megaterium ECU1001和來(lái)自綠豆的環(huán)氧水解酶，大大提高了酶的生產(chǎn)能力。在此基礎(chǔ)上，與上海有機(jī)所周佳海課題組合作，利用X－ray晶體衍射方法解析了這2個(gè)酶的三維結(jié)構(gòu)。目前已通過(guò)結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的分子改造獲得了對(duì)大位阻底物萘基縮水甘油醚具有高活性和對(duì)映選擇性的突變體，并首次利用環(huán)氧水解酶對(duì)經(jīng)典心血管藥物普萘洛爾的合成前體進(jìn)行了拆分，實(shí)現(xiàn)了(S)－普萘洛爾的克級(jí)制備。

表2 本課題組對(duì)環(huán)氧水解酶生物催化劑篩選與應(yīng)用的研究成果Table 2 Progress of EHs screening and application

3 EHs的合成應(yīng)用

3.1 底物溶解度問(wèn)題

環(huán)氧水解酶應(yīng)用過(guò)程中存在底物溶解度差(常溫下往往低于5 g/L)和環(huán)氧底物會(huì)發(fā)生自發(fā)水解的問(wèn)題?？赏ㄟ^(guò)提高助溶劑濃度或采用有機(jī)－水兩相反應(yīng)體系解決。如在組合利用AnEH粗酶和酸水解合成 R － Nifénalol? 的工藝路線［17］中，將助溶劑二甲基亞礬(DMSO)或DMT濃度提高到20%(體積分?jǐn)?shù))，解決了底物溶解度低的問(wèn)題。Choi等［47］在用Aspergillus niger細(xì)胞干粉拆分外消旋時(shí)選擇了僅含2%水的環(huán)己烷反應(yīng)體系，雖然EH活性在有機(jī)溶劑的存在下有所降低，但由于解決了環(huán)氧氯丙烷自發(fā)水解的問(wèn)題，使最終產(chǎn)量提高了10倍。Baldascini等［48］利用部分純化 的 Agrobacterium radiobacter EHs，在辛烷/水兩相體系，成功地將底物氧化苯乙烯的使用濃度提高到39 g/L，同時(shí)兩相體系還有利于產(chǎn)物的下游分離純化過(guò)程。

3.2 EHs穩(wěn)定性問(wèn)題

在引入有機(jī)溶劑及提高底物濃度的同時(shí)，往往會(huì)加快EHs的失活，因此提高EHs的穩(wěn)定性也是其應(yīng)用過(guò)程中需要解決的問(wèn)題。在高底物濃度時(shí)重組表達(dá)EHs的整細(xì)胞具有相對(duì)更好的穩(wěn)定性，Lee等［49］利用畢赤酵母表達(dá)了 Rhodococcus glutinis EHs，將它應(yīng)用于500 mmol/L氧化苯乙烯的拆分，獲得了98%e.e.和36%收率。此外，通過(guò)加入環(huán)糊精可以提高底物溶解度同時(shí)起到底物緩釋的作用。通過(guò)加入200 g/L的羥丙基－β－環(huán)糊精(HPB)，苯乙烯氧化物在15℃的溶解度提高了7倍，同時(shí)不影響 Rhodococcus glutinis EHs的穩(wěn)定性［50］。Jia 等［45］利用DEAE纖維素對(duì)Bacillus megaterium的EHs進(jìn)行了固定化，固定化酶可循環(huán)使用10次。Genzel等［51］通過(guò)降低反應(yīng)溫度至4℃，利用AnEH合成了化學(xué)方法難以獲得的(S)－2－，－3－，－4－環(huán)氧吡啶，同時(shí)他們還用純水代替了緩沖液，簡(jiǎn)化了下游分離過(guò)程。Choi等［52］將 Rhodococcus glutinis EHs制成中空纖維膜反應(yīng)器應(yīng)用于兩相拆分體系，降低了有機(jī)溶劑與底物對(duì)酶的失活作用，同時(shí)產(chǎn)物的及時(shí)移除解決了產(chǎn)物抑制問(wèn)題。

4 總結(jié)及展望

EHs催化的手性環(huán)氧化物與二醇的合成路線為人們提供了一種可能取代化學(xué)方法的高效、專一、環(huán)境友好的合成方法。隨著分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的從保藏菌種和環(huán)境中篩選EHs的方法已逐漸被基因工程挖掘和蛋白質(zhì)工程改造的方法所取代。大量來(lái)源于微生物、動(dòng)物、植物的具有不同選擇性和底物多樣性的EHs已被克隆表達(dá)，為有機(jī)化學(xué)家提供了更多的選擇。大量的基因信息更為我們提供了廣闊的新酶開(kāi)發(fā)空間，而包括定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)在內(nèi)的蛋白質(zhì)工程技術(shù)將使EHs更好地識(shí)別非天然底物，獲得更高的活性和選擇性。

自2000年以來(lái)，隨著大量EHs表達(dá)菌株的發(fā)現(xiàn)及EHs基因的克隆表達(dá)，酶的大量獲得已不再是限制其應(yīng)用的主要因素。而進(jìn)一步將EHs應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，主要還受限于EHs的選擇性及穩(wěn)定性。相信對(duì)嗜熱微生物來(lái)源的EHs的克隆表達(dá)、EHs選擇性的分子改造以及對(duì)映歸一性合成路線的構(gòu)建將成為今后幾年的研究熱點(diǎn)。

［1］Zelaszczyk D，Kiec-Kononowicz K.Biocatalytic approaches to optically active beta-blockers［J］.Curr Med Chem，2007，14:53-65.

［2］Agustian J，Kamaruddin A H，Bhatia S.Single enantiomeric betablockers:the existing technologies［J］.Process Biochem，2010，45:1587-1604.

［3］Choi W J，Choi C Y.Production of chiral epoxides:Epoxide hydrolase-catalyzed enantioselective hydrolysis［J］.Biotechnol Bioproc Eng，2005，10:167-179.

［4］Oesch F.Mammalian epoxidehydrases:inducibleenzymes catalysing the inactivation of carcinogenic and cytotoxic metabolites derived from aromatic and olefinic compounds［J］.Xenobiotica，1973，3:305-340.

［5］Hammock B D，Gill S S，Stamoudis V，et al.Soluble mammalian epoxide hydratase:action on juvenile hormone and other terpenoid epoxides［J］.Comp Biochem Physiol B，1976，53:263-265.

［6］Nardini M，Ridder I S，Rozeboom H J，et al.The X-ray structure of epoxide hydrolase from Agrobacterium radiobacter AD1:an enzyme to detoxify harmful epoxides［J］.J Biol Chem，1999，274:14579-14586.

［7］Argiriadi M A，Morisseau C，Hammock B D，et al.Detoxification of environmental mutagens and carcinogens:structure，mechanism，and evolution of liver epoxide hydrolase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96:10637-10642.

［8］Zou J，Hallberg B M，Bergfors T，et al.Structure of Aspergillus niger epoxide hydrolase at 1.8 resolution:implications for the structure and function of the mammalian microsomal class of epoxide hydrolases［J］.Structure，2000，8:111-122.

［9］Hanzlik R P，Edelman M，Michaely W J，et al.Enzymatic hydration of［18O］epoxides:role of nucleophilic mechanisms［J］.J Am Chem Soc，1976，98:1952-1955.

［10］Lacourciere G M，Armstrong R N.The catalytic mechanism of microsomal epoxide hydrolase involves an ester intermediate［J］.J Am Chem Soc，1993，115:10466-10467.

［11］Thunnissen M M G M，Nordlund P，Haeggstrom J Z.Crystal structure of human leukotriene A4 hydrolase，a bifunctional enzyme in inflammation ［J］.Nat Struct Mol Biol，2001，8:131-135.

［12］Arand M，Hallberg BM，Zou J Y，et al.Stracture of Rhodococcus erythropolis limonene-1，2-epoxide hydrolase reveals a novel active site［J］.2003，22:2583-2592.

［13］Mischitz M，F(xiàn)aber K.Asymmetric opening of an epoxide by azide catalyzed by and immobilized enzyme preparation from Rhodococcus sp.［J］.Tetrahedron Lett，1994，35(1):81-84.

［14］Pedragosa-moreau S，Archelas A，F(xiàn)urstoss R.Microbiological transformations 28:enantiocomplementary epoxide hydrolyzes as a preparative access to both enantiomers of styrene oxide［J］.J Org Chem，1993，58(20):5533-5536.

［15］Elfstrom L T，Widersten M.Catalysis of potato epoxide hydrolase，StEH1 ［J］.Biochem J，2005，390:633-640.

［16］Xu W，Xu J H，Pan J，et al.Enantioconvergent hydrolysis of styrene epoxides by newly discovered epoxide hydrolases in mung bean ［J］.Org Lett，2006，8:1737-1740.

［17］Pedragosa-Moreau S，Morisseau C，Baratti J，et al.Microbiological transformations 37:An enantioconvergent synthesis of the betablocker(R)-Nifenalol? using a combined chemoenzymatic approach［J］.Tetrahedron，1997，53:9707-9714.

［18］Mischitz M，Kroutil W，Wandel U，et al.Asymmetric microbial hydrolysis of epoxides［J］.Tetrahedron:Asymmetry，1995，6(6):1261-1272.

［19］Simeo Y，F(xiàn)aber K.Selectivity enhancement of enantio-and stereocomplementary epoxide hydrolases and chemo-enzymatic deracemization of(+/－ )-2-methylglycidyl benzyl ether［J］.Tetrahedron:Asymmetry，2006，17:402-409.

［20］Zocher F，Enzelberger M M，Bornscheuer U T，et al.Epoxide hydrolase activity of Streptomyces strains ［J］.J Biotechnol，2000，77:287-292.

［21］Tang Y F，Xu J H，Ye Q，et al.Biocatalytic preparation of(S)-phenyl glycidyl ether using newly isolated Bacillus megaterium ECU1001 ［J］.J Mol Catal B:Enzymatic，2001，13:61-68.

［22］Pan J，Xu J H.Marked enhancement of epoxide hydrolase production from Trichosporon loubierii ECU1040 by substrate induction and fed-batch fermentation［J］.Enzyme Microb Tech，2003，33:527-533.

［23］Li C F，Liu Q，Song X，et al.Epoxide hydrolase-catalyzed resolution ofethyl3-phenylglycidate using whole cellsof Pseudomonas sp［J］.Biotechnol Lett，2003，25:2113-2116.

［24］Liu Z，Li Y，Ping L，et al.Isolation and identification of a novel Rhodococcus sp ML-0004 producingepoxidehydrolaseand optimization of enzyme production［J］.Process Biochem，2007，42:889-894.

［25］Barth S，F(xiàn)ischer M，Schmid R D，et al.Sequence and structure of epoxide hydrolases:A systematic analysis［J］.Proteins-Structure Function and Bioinformatics，2004，55:846-855.

［26］Liu Z Q，Li Y，Xu Y Y，et al.Cloning，sequencing，and expression of a novel epoxide hydrolase gene from Rhodococcus opacus in Escherichia coli and characterization of enzyme［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74:99-106.

［27］Lee S J，Kim H S，Kim S J，et al.Cloning，expression and enantioselective hydrolytic catalysis of a microsomal epoxide hydrolase from a marine fish，Mugil cephalus［J］.Biotechnol Lett，2007，29:237-246.

［28］Woo J H，Kang J H，Kang S，et al.Cloning and characterization of an epoxide hydrolase from Novosphingobium aromaticivorans［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2009，82:873-881.

［29］Kotik M，Stepanek V，Maresova H，et al.Environmental DNA as a source of a novel epoxide hydrolase reacting with aliphatic terminal epoxides［J］.J Mol Catal B:Enzymatic，2009，56:288-293.

［30］Lin S J，Horsman G P，Shen B.Characterization of the epoxide hydrolase NcsF2 from the neocarzinostatin biosynthetic gene cluster［J］.Org Lett，2010，12:3816-3819.

［31］Lin S J，Horsman G P，Chen Y H，et al.Characterization of the SgcF epoxide hydrolase supporting an (R)-vicinaldiol intermediate for enediyne antitumor antibiotic C-1027 biosynthesis［J］.J Am Chem Soc，2009，131:16410-16417.

［32］Liu Z Q，Zhang L P，Cheng F，et al.Characterization of a newly synthesized epoxide hydrolase and its application in racemic resolution of(R，S)-epichlorohydrin ［J］.Cata Commun，2011，16:133-139.

［33］Kumar R，WaniSI，ChauhanN S，etal.Cloningand characterization ofan epoxide hydrolase from Cupriavidus metallidurans-CH34 ［J］.Protein Expr Purif，2011，79:49-59.

［34］Zhao J，Chu Y Y，Li A T，et al.An unusual(R)-selective epoxide hydrolase with high activity for facile preparation of enantiopure glycidyl ethers［J］.Adv Synth Catal，2011，353:1510-1518.

［35］Smit M S，Labuschagne M.Diversity of epoxide hydrolase biocatalysts［J］.Curr Org Chem，2006，10:1145-1161.

［36］van Loo B，Spelberg J H，Kingma J，et al.Directed evolution of epoxide hydrolase from A.radiobacter toward higher enantioselectivity by error-prone PCR and DNA shuffling［J］.Chem Biol，2004，11:981-990.

［37］Reetz M T，Torre C，EipperA，etal.Enhancing the enantioselectivity of an epoxide hydrolase by directed evolution［J］.Org Lett，2004，6:177-180.

［38］Nardini M，Rick R B，Janssen D B，et al.Structure and mechanism ofthe epoxide hydrolase from Agrobacterium radiobacter AD1［J］.J Mol Catal B:Enzymatic，2001，11:1035-1042.

［39］Thomaeus A，Naworyta A，Mowbray S L，et al.Removal of distal protein-water hydrogen bonds in a plant epoxide hydrolase increases catalytic turnover but decreases thermostability［J］.Protein Sci，2008，17:1275-1284.

［40］Reetz M T，Bocola M，Wang L W，et al.Directed evolution of an enantioselective epoxide hydrolase:uncovering the source of enantioselectivity at each evolutionary stage［J］.J Am Chem Soc，2009，131:7334-7343.

［41］Kotik M，Archelas A，F(xiàn)amerova V，et al.Laboratory evolution of an epoxide hydrolase-towards an enantioconvergent biocatalyst［J］.J Biotechnol，2011，156:1-10.

［42］Xu Y，Xu J H，Pan J，et al.Biocatalytic resolution of glycidyl aryl ethers by Trichosporon loubierii:cell/substrate ratio influences the optical purity of(R)-epoxides［J］.Biotechnol Lett，2004，26:1217-1221.

［43］Xu W，Xu J H，Pan J，et al.Enantioconvergent hydrolysis of styrene epoxides by newly discovered epoxide hydrolases in mung bean ［J］.Org Lett，2006，8:1737-1740.

［44］He W H，Hua Y，F(xiàn)an L Q.Isolation of total RNA and cloning of epoxide hydrolase gene from Vigna radiata ［J］.Food Drug，2011，13:100-103.

［45］Jia T，Xu J，Yang S.Immobilization of Bacillus megaterium epoxide hydrolase and its catalytic performance［J］.Chin J Catal，2008，29:47-51.

［46］Ju X，Pan J，Xu J H.Enantioconvergent hydrolysis of pnitrostyrene oxide catalyzed by mung bean epoxide hydrolase［J］.Chin J Catal，2008，29:696-700.

［47］Choi W J，Lee E Y，Yoon S J，et al.Biocatalytic production of chiral epichlorohydrin in organic solvents［J］.J Biosci Bioeng，1999，88:339-341.

［48］Baldascini H，Ganzeveld K J，Janssen D B，et al.Effect of mass transfer limitations on the enzymatic kinetic resolution of epoxides in a two-liquid-phase system ［J］.Biotechnol Bioeng，2001，73:44-54.

［49］Lee E Y，Yoo S S，Kim H S，et al.Production of(S)-styrene oxide by recombinant Pichia pastoris containing epoxide hydrolasefrom Rhodotorula glutinis［J］.Enzyme Microb Tech，2004，35:624-631.

［50］Yeates C A，Krieg H M，Breytenbach J C.Hydroxypropyl-βcyclodextrin induced complexation for the biocatalytic resolution of a poorly soluble epoxide［J］.Enzyme Microb Tech，2007，40:228-235.

［51］Genzel Y，Archelas A，Broxterman Q B，et al.Microbiological transformations.47.A step toward a green chemistry preparation of enantiopure(S)-2-，-3-，and-4-pyridyloxirane via an epoxide hydrolase catalyzed kinetic resolution［J］.J Org Chem，2001，66:538-543.

［52］Choi W J，Choi C Y，De Bont J A M，et al.Resolution of 1，2-epoxyhexane by Rhodotorula glutinis using a two-phase membrane bioreactor［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1999，53:7-11.